PLGA微球联合G-CSF、EPO和VEGF促进大鼠缺血下肢血管再生的实验研究

朱仙花 陈锋 刘崇栋 周卫 唐新华

［摘要］ 目的 探讨肌肉注射分别携载粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、促红细胞生成素（EPO）和血管内皮生长因子（VEGF）的葡聚糖/PLGA微球对缺血下肢血管再生的影响。 方法 制备分别携载G-CSF、EPO和VEGF的PLGA微球，通过扫描电镜观察其表面形态；利用ELISA法检测其包封率和累积释放率。雄性大鼠24只，制作成右下肢缺血模型，随机分成2组：PLGA组，肌肉注射分别携载G-CSF、EPO和VEGF的PLGA微球的纤维蛋白凝胶；对照组，注射空载的PLGA微球的纤维蛋白凝胶。处理后第1周和第4周分别处死6只大鼠，行组织学和免疫组化检测，计数血管密度。结果  G-CSF/PLGA，EPO/PLGA和VEGF/PLGA微球的包封效率分别为84％±4.2,85％±4.0,82％±3.8（w/w）。PLGA组的毛细血管密度和SMA阳性血管密度明显高于对照组。PLGA组肌组织内增殖细胞核抗原、B淋巴细胞瘤-2基质细胞衍生因子-1和趋化因子基质细胞衍生因子-4高表达。结论 利用葡聚糖/PLGA微球联合多种血管再生因子治疗下肢缺血是一种有前途的血管再生方法。

关键词：粒细胞集落刺激因子; 促红细胞生成素; 血管内皮生长因子;微球; 缺血

Experimental study of PLGA microspheres combined with G-CSF, EPO and VEGF on promoting neovascularization in ischemic lower limbs of rats

Abstract 

Aim To investigate the effects of intramuscular injection of dextran/PLGA microspheres loaded with granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), erythropoietin (EPO) and vascular endothelial growth factor (VEGF) on the neovascularization of ischemic lower limb

Methods PLGA microspheres carrying G-CSF, EPO and VEGF were prepared and their surface morphology was observed by scanning electron microscopy. The encapsulation efficiency and cumulative release rate were detected by ELISA method. 24 male rats with lower limb ischemia were randomly divided into two groups: PLGA group, intramuscularly injected with fibrin gel loaded with PLGA microspheres respectively carrying G-CSF, EPO and VEGF; control group, injected with PBS. Six rats were sacrificed at the 1 week and the 4 weeks after treatment, respectively. Histological and immunohistochemical examination were performed, and vascular density was evaluated.

Results The encapsulation efficiencies of G-CSF/PLGA, EPO/PLGA and VEGF/PLGA microspheres were 84% ± 4.2, 85% ± 4.0, 82% ± 3.8, respectively. Capillary density and SMA-positive vascular density in the PLGA group were significantly higher than those in the control group. High expression of proliferating cell nuclear antigen, B-cell lymphoma-2, stromal cell derived factor 1 and C-X-C chemokine receptor type4 was found in the muscle tissue of the PLGA group.

Conclusions The use of dextran/PLGA microspheres combined with multiple angiogenic factors to treat lower limb ischemia is a promising therapeutic angiogenesis method.

Keywords: granulocyte colony-stimulating factor; erythropoietin; vascular endothelial growth factor; microsphere; ischemia

缺血性血管疾病是世界上发病率和死亡率较高的一种疾病，具有较高的致死率和致残率。其治疗性研究中最重要研究方向就是治疗性血管再生。它是指通过给予具有血管再生作用的生长因子、因其和细胞来促进新的血管生成^［1］。目前以血管生长因子为基础的治疗性血管再生研究所遇到主要障碍有：（1）血管再生是一个复杂的过程，需要多种血管生长因子或细胞的参与；（2）血管生长因子的半衰期短。

VEGF可促进内皮细胞（ECs）增殖和迁移来诱导血管生成。EPO和G-CSF是造血生长因子，临床用于动员造血干细胞和祖细胞。同时它们可以促进多种细胞群的动员、增殖和分化来诱导血管再生^［2、3］。本研究拟联合血管内皮生长因子（VEGF）、促红细胞生成素（EPO）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）促血管再生，以弥补单一血管生长因子的不足。血管生长因子的半衰期短。如果为了保持有效治疗浓度，需经常注射。葡聚糖/PLGA微球药物缓释系统可以使药物在作用部位持续释放维持有效药物浓度^［4］。本研究拟肌注携载G-CSF、EPO和VEGF的葡聚糖/PLGA微球纤维蛋白胶来促进大鼠缺血下肢血管再生。

材料与方法

一、 材料

重组人G-CSF和EPO（PeproTech），重组大鼠VEGF 165（PeproTech），葡聚糖（Sigma-Aldrich），PEG（Sigma-Aldrich公司），人G-CSF和EPO的ELISA试剂盒（R＆D Systems），大鼠VEGF165 ELISA试剂盒（R＆D Systems）、聚乙烯醇（Sigma-Aldrich公司），α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗、基质细胞衍生因子1（SDF-1）一抗（Abcam），B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）一抗（Abcam），CXC趋化因子受体4（CXCR4）一抗（Abcam），抗兔和抗鼠二抗（博士德公司）

二、 方法

2.1 PLGA微球的制作备

将重组人G-CSF（EPO或重组大鼠VEGF165）、葡聚糖和PEG以1：5：50（w / w / w）的比例混合，1500rpm搅拌60秒，置于-80℃冰箱中12h，然后冻干24h。 用二氯甲烷洗涤冻干粉末，12000rpm离心后去除上清液。 洗完三次后真空干燥24h。然后将G-CSF-葡聚糖微粒溶于含PLGA（15％，w / w）的二氯甲烷中溶液中，立即搅拌60s，加入5倍体积含有聚乙烯醇(1%,w/v) 的NaCl (5%, w/v) 溶液中。搅拌后将其倒入200倍体积的NaCl (10 %, w/w )溶液中，于4℃搅拌4小时固化微球。然后用去离子水洗涤微球，最后冻干24小时，制成VEGF /葡聚糖/ PLGA，G-CSF /葡聚糖/ PLGA和EPO /葡聚糖/ PLGA微球待用。 

2.2 PLGA微球的基本特性

取适量的微球粉末置于导电胶上，均匀涂布，喷金后用扫描电子显微镜（SEM）观察颗粒大小和表面形态特征。 

称取微球20mg，加入二氯甲烷中，使其完全溶解，10000rpm离心5min除去上清液，将其溶于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用ELISA试剂盒测量细胞因子的浓度，包封效率= 微球中蛋白质的实际重量/制备微球所用的蛋白质总量×100％。

称取20mg微球置于含有叠氮化钠的PBS 液中，于37℃恒温摇床中进行释放试验。每2天取样1次，然后补充新鲜PBS液。用ELISA试剂僵测定细胞因子的浓度，绘制累积释放曲线。

2.3大鼠下肢缺血模型和分组

6周龄雄性SD大鼠24只（200-250g），3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，于腹股沟韧带上髂外动脉至股动脉延伸为腘动脉处用1号丝线结扎并完整切除股动脉。制成的大鼠下肢肢缺血模型随机分成2组：PLGA组，大腿内侧肌肉分5点注射载有G-CSF /葡聚糖/ PLGA，EPO /葡聚糖/ PLGA和VEGF /的纤维蛋白凝胶（体积=200μl，G-CSF =70μg/只，EPO = 2000U /只，VEGF =70μg/只）；对照组，肌注空载的葡聚糖/ PLGA微球的纤维蛋白凝胶。

2.4 组织学检测

于治疗后的第1周和第4周每组处死6只大鼠，取大腿内侧肌肉组织，4%多聚甲醛固定，冰冻切片厚6μm，用内源性碱性磷酸酶显示组织中毛细血管，计数毛细血管密度（毛细血管数/肌纤维数）。用针对α- SMA的一抗行免疫组化染色，计数α-SMA阳性的血管密度（SMA阳性血管数/肌纤维数）；用针对PCNA、SDF-1、Bcl-2、CXCR4一抗行免疫组化染色。

三、统计分析

所有实验数据以ｘ±S表示，用SPSS 13.0软件进行统计分析，两组参数间的比较采用t检验，以P <0.05为差异有统计学意义。

结果

一、PLGA微球的基本特性 

用SEM扫描法观察葡聚糖/ PLGA微球具有球形和光滑表面，直径为40至120μm（图1）。G-CSF /葡聚糖/ PLGA，EPO /葡聚糖/ PLGA和VEGF /葡聚糖/ PLGA微球的包封效率分别为84％±4.2，85％±4.0，82％±3.8。蛋白质/葡聚糖/ PLGA微球可以缓释超过4周（图1）。G-CSF，EPO和VEGF的累积释放率分别为约89.5％，90.3％和91.2％。

二、PLGA微球促进血管再生 

肌组织中毛细血管用碱性磷酸酶染色法染成紫色，SMA阳性血管免疫组化染色棕色。PLGA组毛细血管密度和SMA阳性血管密度明显高于对照组。

三、PLGA微球促进肌组织Bcl-2高表达和细胞增殖

于治疗后第1周，用针对Bcl-2的一抗行免疫组化染色。如图所示，PLGA组肌组织可见大量Bcl-2阳性细胞。为了检测组织细胞的增殖活性，用PCNA一抗行免疫组化染色。 如图所示，PLGA组肌组织可见大量增殖活跃的PCNA阳性细胞。

表1各实验组缺血肌组织血管密度（x±s，/fiber）

四、PLGA微球促进肌组织SDF-1高表达和CXCR4阳性细胞动员 

于治疗后第7天，行SDF-1一抗的免疫组化染色，如图所示，PLGA组肌组织可见大量表达SDF-1的细胞。  如图HE染色所示，PLGA组肌肉组织可见大量细胞浸润。行CXCR4 免疫组化染色，如图所示，PLGA组肌组织浸润的细胞中有些呈CXCR4阳性。

讨论

PLGA因其优秀的生物降解性和生物相容性，已被广泛地应用于医药领域。其中蛋白质/葡聚/PLGA微球是一种理想的蛋白质类药物缓释系统^［5］。它不仅可以使药物在作用部位持续释放维持有效药物浓度，而且它还可以减少微球制备过程中蛋白质药物的变性和聚集，从而有效的防止药物的减弱和免疫原性的产生。本实验结果表明，蛋白质葡聚糖/ PLGA微球可以持续释放药物超过4周。肌注VEGF /葡聚糖/ PLGA，G-CSF /葡聚糖/ PLGA和EPO /葡聚糖/ PLGA微球可以明显提高肌组织中毛细胞血管密度和SMA阳性血管密度，具有显著的促血管再生效果。

本研究发现VEGF，G-CSF和EPO的联合应用可以促进肌组织中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并提高PCNA +增殖细胞的数量。首先，VEGF作为ECs的有丝分裂原，可以抑制ECs的凋亡，促进ECs的分裂增殖.^［6］ VEGF可以促进ECs中Bcl-2的表达，并增加PCNA 阳性ECs的数量。其次，G-CSF可以动员骨髓中单核细胞等血细胞至肌组织中。这些细胞可以表达血管生成因子如VEGF和PDGF促进血管再生^［7、8］。而G-CSF还可以促进这些细胞表达Bcl-2和PCNA，抑制其凋亡。第三，EPO受体（EPOR）不仅存在于红系造血祖细胞，而且在各种非造血细胞中表达，如ECs^［2、9］。EPO/EPOR可通过激活Janus激酶2信号分子来控制细胞的增殖、存活和基因表达^{［2、9、10］}。EPO/EPOR可增强ECs的增殖、存活和迁移，保护它们免受缺血而出现凋亡^{［2、9、11］}，在体外和体内实验中都能促进血管生成^［2、12］。8,11,48 EPO也可增强ECs中的Bcl-2和PNCA的表达。因此，联合G-CSF、VEGF和EPO可以协同增加缺血肌组织中Bcl-2和PCNA阳性细胞的数量，从而抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和血管再生。

本研究发现VEGF，G-CSF和EPO的联合应用可以促进肌组织SDF-1的高表达并增加CXCR4阳性细胞的动员。首先，Lin等^［13］发现EPO促进SDF-1的高表达，而EPOR抗体可以阻断该作用，EPO直接影响着SDF-1的表达。谁^［14］发现EPO可诱导SDF-1从造血细胞特别是血小板中释放，从而促进缺血肢体的血管生成^［15］。CXCR4作为SDF-1的受体，被骨髓源性细胞广泛表达，如造血细胞，内皮祖细胞，平滑肌祖细胞等。这些细胞具有直接或间接促血管再生能力^［16］。因此SDF-1/CXCR4可以调控干/祖细胞的动员和血管再生^［17］。EPO通过增加SDF-1的表达，动员CXCR4阳性细胞来促进血管再生。其次，VEGF受体2（VEGFR2）和CXCR4阳性细胞代表促血管生成细胞的特定亚群，具有重叠表型，并分别由VEGF-A和SDF-1动员^［18］。研究发现VEGF也需要通过CXCR4/SDF-1来动员骨髓细胞来促进血管生成。EPO和VEGF对CXCR4 +细胞的动员具有协同作用。第三，G-CSF是一种造血因子。但它还可以动员骨髓来源的单核细胞和祖细胞，并促进其分泌各种促血管生成因子或分化为ECs，平滑肌细胞或血管周细胞，来促进血管再生^［7、8］。Misao等发现，通过CXCR4/SDF-1，G-CSF可以动员募集CXCR4⁺细胞到缺血组织，促进血管再生^［18］。因此，联合G-CSF、VEGF和EPO可以协同增加缺血肌组织中SDF-1的表达，并动员CXCR4+细胞促进血管再生。

综上所述，大鼠缺血下肢肌肉注射分别携载G-CSF、EPO和VEGF的葡聚糖/PLGA微球可以通过协同促进Bcl-2的表达和促细胞增殖作用；协同增加SDF-1的表达和CXCR4+细胞的动员来促进血管再生。它是一种较理想的联合多因子的治疗性血管再生方法。

图1 PLGA微球电镜扫描图

图2 PLGA微球体外累积释放曲线

A                                             B

图3肌组织碱性磷酸酶染色，A: 对照组；B：PLGA组

A                                             B

图4 肌组织SMA免疫组化染色，A: 对照组；B：PLGA组

A                                             B

图5肌组织苏木素伊红染色，A: 对照组；B：PLGA组

A                                             B

图6肌组织Bcl-2免疫组化染色，A: 对照组；B：PLGA组

A                                             B

图7肌组织PCNA免疫组化染色，A: 对照组；B：PLGA组

A                                             B

图8肌组织SDF-1免疫组化染色，A: 对照组；B：PLGA组

A                                             B

图9肌组织CXCR4免疫组化染色，A: 对照组；B：PLGA组

参考

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