快速诊断晚发型甲基丙二酸尿症cb1C型家系并治疗随诊

段晓慧  郝莹  顾卫红^¬  张瑾  汪仁斌

作者单位：100029北京，卫生部中日友好医院神经科

【摘要】 研究背景 经外显子组测序快速确诊晚发型甲基丙二酸尿症cb1C型家系，探讨该病表型特征、病理生理机制，评估治疗和预后。方法 采用目标外显子区序列捕获及高通量测序技术对临床拟诊的遗传代谢病病例进行检测，分析其临床表现、实验室检查、影像学发现、电生理及病理改变和突变特点，并治疗随诊评估预后。结果 检测发现MMACHC基因突变导致的晚发型cb1C家系2例：家系1患病姐妹携带复合杂合突变，c.482G>A（p.R161Q）和c.615C>A(p.Y205X)。姐姐表现为智能减退，下肢痉挛性运动功能障碍伴癫痫发作；脑电图见弥漫性慢波及偶发尖慢波；头颅MRI提示脑萎缩。妹妹表现为轻度智力下降，轴索损害为著的四肢周围神经病变及视神经萎缩更为突出。家系2 患病兄妹携带复合杂合突变：c.440_441del(p.G147fs)和c.482G>A(p.R161Q)。哥哥表现为智力减退，精神行为异常，双下肢无力伴锥体束征；脑电图示弥漫性慢波；头颅MRI示脑萎缩；肌电图和腓肠神经活检提示髓鞘和轴索混合性损害的周围神经病变。患病胞妹症状类似而发病年龄较早。4例患儿经甲钴胺、叶酸、左卡尼汀等联合治疗后智力显著提高，癫痫得以控制，但均遗留不同程度的双下肢运动功能障碍。结论 晚发型cblC临床症状复杂多变，可广泛累及大脑皮质、锥体系、锥体外系、周围神经等，应用基因捕获联合高通量测序技术可以快速诊断该病，早期确诊与治疗对预后至关重要。

 

【关键词】外显子组测序 MMACHC基因 cb1C 甲基丙二酸 高同型半胱氨酸

Rapidly identifies pedigrees with Late-onset Methylmalonic Aciduria and Homocystinuria Type C (cb1C ) and therapeutic follow-up 

Duan Xiaohui, Hao Ying, Gu Weihong,^¬ Zhang Jin, Wang Renbin.

Department of Neurology, China⁃Japan Friendship Hospital, Beijing 100029, China

China

Corresponding author: GU Wei⁃hong (Email: jane55.gu@vip.sina.com)

【Abstract】Objective Rapid diagnosis of late-onset Pedigrees with  Methylmalonic Aciduria and Homocystinuria Type C (cb1C ) by exome sequencing, to explore the phenotypic characteristics, pathophysiological mechanism and treatment outcomes of the disease. Methods The target exons region capture combined with high-throughput sequencing technologies were used to detect the cases of suspected genetic metabolic diseases. The clinical manifestations, laboratory examination, imaging findings, electrophysiological and pathological changes, gene mutation characteristics and management were reviewed. Results The MMACHC gene mutations in pedigree 1 were c.482G>A（p.R161Q）and c.615C>A(p.Y205X). The elder sister presented intelligence deterioration, spastic motor dysfunction of lower limbs and epilepsy; Electroencephalogram showed diffuse slow wave and occasional sharp -slow wave; Cerebellar atrophy was visible in brain MRI. The younger sister presented mild mental retardation, axonal peripheral neuropathy and optic nerve atrophy as prominent manifestations. For pedigree 2, c.440_441del(p.G147fs) and c.482G>A(p.R161Q) were identified. The elder brother presented mental retardation and behavior disorder, weakness of lower limbs with pyramidal sign; EEG showed diffuse slow wave; Brain MRI showed cerebellar atrophy; EMG and sural nerve biopsy suggested myelinated and axonal mixed peripheral neuropathy. The younger sister has similar symptoms and suffered earlier. The patients were treated by mecobalamin, folic acid and levocarnitine, and the prognosis was evaluated. Conclusions The clinical symptoms of late-onset cblC are complex and variable, the cerebral cortex, pyramidal system, extrapyramidal system, peripheral nerve can be widely involved in this disease. Gene capture combined with high-throughput sequencing technology can be used to diagnose the disease rapidly, and early diagnosis and treatment are crucial to improve the prognosis.

【Key words】Exome sequencing; MMACHC gene; cb1C; 

Methylmalonic acid; Hyperhomocysteinemia

 

遗传代谢病是一组涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖类、类固醇等数百种先天性代谢缺陷的疾病群，致病基因繁多，常导致早期夭折或终身残疾。甲基丙二酸尿症（methylmalonic aciduria，MMA）或甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia, MMA）是有机酸代谢病中最常见的类型，由甲基丙二酰辅酶A变位酶（methylmalonyl-CoA  mutase，MCM）或异构酶(methylmalonyl-CoA epimerase，MCE)缺陷及其辅酶钴胺素(VitB₁₂)代谢缺陷所致。目前报道分为12种亚型，13个致病基因^[1,2]。其中cblC型是我国MMA患者的主要生化表型，由MMACHC基因突变导致甲基钴胺素和腺苷钴胺素代谢异常，体内甲基丙二酸(MMA)和同型半胱氨酸(Hcy)蓄积，故称为甲基丙二酸尿症合并同型半胱氨酸血症^[3]。该型具有高度表型变异性^[4]，依据其发病年龄分为早发型（发病年龄≤1岁）和晚发型（发病年龄≥4岁）。晚发cblC型较为罕见，临床症状更广泛多变，多伴有神经系统受累，部分合并其他系统受累，早期诊断积极治疗，预后较早发型好^[5,6]。我们利用外显子组测序技术快速诊断并治疗2例晚发型cblC型家系，并对临床表型、实验室检查、影像学检查、电生理及病理改变、诊疗经过及预后进行总结，提高临床医生对该病的认识，减少漏诊误诊，积极治疗，降低遗传代谢疾病的伤残率。

对象与方法

一、 对象

家系1

该家系2代4人，两姐妹患病，父母体健，非近亲婚配。姐姐13岁，主因“反应迟钝，行走不稳，间断意识丧失伴抽搐3年”，于2014年5月至我院首诊。10岁时家属发现患者反应迟钝，智力减退，学习成绩明显下降。双下肢走路不稳，上楼或蹲起困难，步态异常易摔倒。12岁时有3次发作性意识丧失、四肢阵挛、口周青紫，5-6min左右自行缓解。查体：神清，表情呆滞，语速慢。计算力、理解力差，MMSE评分19分，WISC-IV（韦氏儿童智力量表第四版）评分48分。颅神经检查无异常，双上肢肌力、肌张力正常，双下肢肌力Ⅳ+级，肌张力高，双侧病理征阳性。上肢腱反射对称引出，双下肢腱反射活跃。跟膝胫试验欠稳准，双手轮替动作慢，Romberg征阳性。走路痉挛步态。脑电图提示为前头部弥漫性慢波，偶见两次中波幅尖慢波综合及复形慢波。头颅MRI提示脑萎缩，双侧脑室旁轻度脱髓改变（图1A）。

其胞妹9岁时出现轻度反应迟钝，视物模糊，肢体无力，上肢不能提重物，走路困难进行性加重，11岁坐轮椅。查体：MMSE评分21分，WISC-IV评分61分。双眼视力下降（左眼0.6，右眼0.4），眼底可见视神经苍白萎缩（图1B），余颅神经检查无异常。四肢远端肌肉萎缩，双上肢肌力Ⅳ+级、双下肢肌力Ⅳ-级，四肢肌张力正常。双侧膝腱反射减弱，双侧跟腱反射未引出，双侧病理征中性。四肢远端音叉振动觉及针刺痛觉减弱。肌电图检查：双胫神经感觉运动传导速度减慢，波幅减低；双侧正中神经感觉传导正常，波幅减低，运动传导速度减慢，波幅减低；双侧尺神经感觉运动传导速度正常，感觉波幅减低。提示四肢周围神经源性损害，感觉、运动均受累，轴索损害为主。腓肠神经活检：大直径有髓神经纤维减少，薄髓纤维增多，可见再生簇样结构，提示慢性轴索病变(图1C)。姐妹二人自幼不喜肉类、蛋类、牛奶等食物。血常规均示轻度正细胞正色素性贫血。血清叶酸及维生素B₁₂浓度正常。血Hcy均较正常升高。

家系2

该家系2代4人，1兄1妹患病，父母体健，非近亲婚配。哥哥14岁，主因“行为异常、智力下降，行走不稳2年” 于2015年1月至我院首诊。12岁时出现记忆力减退，注意力不集中，学习成绩下降，不愿与外界交流。腰痛伴双下肢无力，步态不稳，走路慢，易疲劳，14岁坐轮椅。查体：皮肤、结膜略苍白，体型消瘦，弓形足。表情淡漠，语速慢，计算力、定向力差。MMSE评分20分，WISC-IV评分62分。颅神经检查无异常。双上肢肌力正常，双下肢肌力Ⅳ级，远端肌力Ⅲ级，肌张力不高，四肢腱反射减弱。双侧病理征阳性。下肢远端音叉振动觉及针刺痛觉减弱。脑电图示：弥漫性慢波,中度异常脑电图。头颅MRI示脑萎缩(图2A)。肌电图检查上下肢感觉、运动神经传导速度减慢，波幅减低，提示四肢周围神经感觉、运动均受累，髓鞘和轴索混合性损害。腓肠神经活检：大直径有髓神经纤维明显减少，薄髓纤维增多，可见不典型“洋葱球”样结构，偶见再生簇，提示髓鞘和轴索混合性病变（图2B、C）。平时食欲不振，素食偏多，发现轻度贫血3年。血清叶酸正常，维生素B₁₂浓度偏低，血Hcy升高。胞妹6岁，智力及走路、跑步较同岁孩子差。

二、 方法

1. 样本采集

获得知情同意后，采集两家系9位成员外周静脉血5ml，用3.8%枸橼酸钠抗凝，采用标准酚氯DNA提取方法提取基因组DNA。

2. 委托北京金准基因有限公司进行外显子组测序。

利用目标区域捕获、测序法对865个遗传代谢病相关基因的外显子及外显子-内含子交接区进行检测。将每个样本1.5ug基因组DNA随机打断为150-250bp片段，末端修复补平，连接腺嘌呤碱基（A）并加入接头（adaptor），经PCR扩增，得到富集文库。采用Agilent 定制捕获探针（Agilent 公司，美国），覆盖865个基因；对捕获产物进行PCR扩增，纯化并进行定量。 使用Illumina Hiseq X-ten高通量测序仪（Illumina公司，美国）进行测序，测序策略为PE-150。将原始序列数据（FASTQ）去除接头及低质量序列，经BWA-0.7.12软件比对至人类基因组参考序列（GRCh37）上，Picard工具包去除重复序列，使用基因组分析工具包GATK（TheGenome Analysis Toolkit）检测单核苷酸变异与插入缺失变异，经过ANNOVAR软件［version：2016-05-1110：54：48-0700（Wed，11 May2016）］对变异位点进行注释，筛选致病突变。对可疑致病突变进行一代测序验证、家系共分离检测。

3. 完善检查评估治疗

应用气相色谱-质谱联用分析技术(GC—MS)对4例患儿治疗前后的尿液有机酸进行分析。复查血尿常规、肝肾功能、血氨、血乳酸、血气、血同型半胱氨酸、神经电生理及影像学、智力测试等，评估治疗效果。

结果

一、 基因检测结果

测序分析发现：家系1中患病姐妹在MMACHC基因第四外显子区域发现

复合杂合突变c.482G>A（p.R161Q）和c.615C>A(p.Y205X)，家系验证c.482G>A来自父亲，c.615C>A来自母亲；家系2中患病兄妹在MMACHC基因第四外显子区域发现复合杂合突变c.440_441del(p.G147fs)和c.482G>A(p.R161Q)，家系验证p.G147fs来自母亲，c.482G>A来自父亲。

二、实验室及辅助检查结果 

4个患者尿有机酸分析(气相色谱．质谱联用分析，GC／MS)均显示甲基丙

二酸、甲基枸橼酸浓度明显增高。家系1中患病姐妹血清叶酸及维生素B₁₂浓度正常，血Hcy升高；姐姐尿微量蛋白增加，提示轻度肾损伤。家系2中患病哥哥血清叶酸正常，维生素B₁₂浓度偏低，乳酸略增高；患病胞妹血清叶酸及维生素B₁₂浓度正常；两患儿血Hcy均升高。另外4个患儿均有轻度贫血。其余辅助检查见表1。

三、诊治与随访结果 

4例患儿临床表现、辅助检查，基因检测及尿有机酸分析结果均符合甲基丙二酸尿症CblC晚发型诊断。针对原发病，给予甲钴胺（1mg/d）、甲基四氢叶酸钙 (6mg/d)、左卡尼汀(1g/d)肌肉注射两周，4例患儿病情逐步改善。后改为甲钴胺、左卡尼汀口服维持，同时给予叶酸、甜菜碱口服，辅以低蛋白、高热量饮食。半年后随访，家系1两姐妹智力基本恢复正常，可正常就读初中，但都遗留双下肢运动功能障碍，走路步态异常，跑跳困难。妹妹视力维持在0.8水平。家系2中哥哥智力、情绪基本恢复正常，升入高中继续求学，留有走路摇摆步态。患病胞妹智力运动发育亦显著进步，运动较同龄儿稍差。实验室化验尿甲基丙二酸、甲基枸橼酸浓度，血、尿常规，血清叶酸、维生素B₁₂及Hcy水平复查均正常。家系1姐姐和家系2哥哥复查脑电图均未见癫痫样放电，偶见少量慢波，提示边缘状态。4例患儿WISC-IV评分均符合正常儿童分值。

讨论

MMA是有机酸代谢病中最常见类型，1967年由Rosenberg等首次报道。该病目前分为12个亚型（13个相关致病基因）^[2]：MCM缺陷（MUT）和MCE缺陷（MCEE）；辅酶缺陷包括cblA（MMAA）、cblB（MMAB）、cblC（MMACHC）、cblD（MMADHC）、cblF（LMBRDL）、cblJ(ABCD4)、钼辅因子缺乏症A(MOCSl)、钼辅因子缺乏症B(MOCS2)、钼辅因子缺乏症C(GPHN)；线粒体DNA缺失综合征9（SUCLGl和SUCLG2）。其中cblC、cblD、cblF、cblJ、钼辅因子缺乏症A、钼辅因子缺乏症B、钼辅因子缺乏症C可同时导致辅酶脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素合成障碍，引起体内甲基丙二酸及同型半胱氨酸蓄积，称为甲基丙二酸尿症合并同型半胱氨酸血症。由于MMA相关基因较多，采用PCR反应和Sanger测序技术进行检测，费时费力且成本高，也不能检测基因的缺失或重复突变。基因捕获联合高通量测序技术可在同一张芯片上高特异性和高覆盖率捕获目标外显子区域，直接解析数据、筛选出突变位点，具有快速准确、低成本的优点，可同时检测多种类型突变。本研究利用外显子组测序技术对临床拟诊的遗传代谢病家系进行检测，快速确诊了两例晚发cblC型家系。

cblC型是我国MMA患者的主要生化表型，2006年Lemer-Ellis^[7]等鉴定出cblC型的编码基因MMACHC定位于lp34.1，包括5个外显子，有846bp的开放阅读框，编码蛋白含282个氨基酸，主要功能是催化氰钴胺素还原脱氢和合成腺苷钴胺素及甲基钻胺素。当MMACHC基因发生突变时，机体内甲基丙二酸及同型半胱氨酸蓄积伴甲硫氨酸降低。目前人类基因突变数据库（the Human Gene Mutation Database, HGMD) ( http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）已报道的MMACHC基因突变类型将近100种，其中导致晚发型cblC 的突变不到 20%^[8]。本研究中两个家系患者均携带杂合性c.482G>A（p.R161Q）突变，我们总结了该突变位点的文献报道^[7,9]，均为杂合子，而且大多为晚发型cblC，推测杂合性c.482G>A突变与晚发型cblC有一定的相关性，而且该突变在我国的突变频率较高^[10]。家系1患儿携带的另一终止突变c.615C>A(p.Y205X)在国外已有报道，在国内罕有报道。Lemer-Ellis曾报道一例携带c.482G>A和c.615C>G复合杂合突变的晚发型cblC家系，以智力下降为主要表型^[7]。家系2患儿携带的移码突变c.440_441del(p.G147fs)，导致氨基酸编码在第180位提前终止，且此突变定位于MMACHC蛋白的重要功能结构域-Vitbl2结合区。该突变在国外未见报道，国内曾报道一个c.440_441del和c.609G>A(p.W203X)复合杂合突变导致早发型cblC的病例^[11]，推测移码和终止突变对蛋白结构影响大并致病性强，故表型早发且严重。而我们报道的家系2患儿为晚发型cblC，考虑同时携带的错义突变c.482G>A对蛋白结构影响相对较弱。另外，本研究发现的三种突变均发生在第4外显子上，说明该区属于突变热点域。

晚发型cblC（发病年龄≥4岁）较为罕见，临床症状广泛多变，多伴有神经系统受累，部分合并其他系统受累^[9]。本研究发现的2个家系均为晚发型cblC，但临床表现各不相同。家系1中姐姐表现为智能减退（MMSE 19分，WISC-IV 48分），下肢痉挛性运动功能障碍伴癫痫发作；脑电图可见前头部弥漫性慢波，偶见尖慢波综合及复形慢波；头颅MRI提示脑萎缩，双侧脑室旁轻度脱髓改变。妹妹表现为轻度智力下降（MMSE 21分，WISC-IV 61分），四肢周围神经病变及视神经萎缩，肌电图和腓肠神经活检均提示轴索损害为著的周围神经病变。携带相同突变的两姐妹，一个表现为大脑皮层、锥体束和锥体外系损害为著，一个表现为周围神经损害为著，可见本病临床表现的多样性。Roze等也曾报道过1例晚发cblC型患病姐妹家系，一个表现为智能减退，精神异常，伴双下肢无力；一个表现为脊髓亚急性联合变性综合征^[12]。家系2中哥哥表现为智力减退（MMSE 20分，WISC-IV 62分），性格改变，情绪异常，双下肢肌力下降伴锥体束征；脑电图示弥漫性慢波，中度异常；头颅MRI示脑萎缩；肌电图和腓肠神经活检提示四肢周围神经感觉、运动均受累，髓鞘和轴索混合性损害。提示患者神经系统广泛受累，包括大脑皮质、锥体系、周围神经受累。而其患病胞妹发病年龄更早，也累及神经系统多处损害。结合本文并回顾以往报道的晚发型cblC病例：精神行为异常，进行性智力并运动功能倒退是晚发型cblC较常见的表现，相比早发型cblC，晚发型起病隐袭，运动障碍表现突出，智力损害相对轻^[9,10]；常合并脊髓、周围神经系统、视神经、锥体外系等损害；脑电图显示弥漫性慢波，提示皮层广泛性损害，少数可发现明显的癫痫波，癫痫症状可表现强直-阵挛发作、强直发作、阵挛发作及部分运动性发作^[13]；核磁影像可见脑室周围白质异常、脑萎缩、脑室扩张、脊髓萎缩等异常^[14,15]；脑病理改变以脑、脊髓多灶性脱髓鞘为特征，周围神经改变有轴索变性、髓鞘变薄、神经纤维再生，提示慢性轴索病变或轴索-髓鞘混合病变；眼底检查发现视神经萎缩和视网膜色素变性对该病诊断也有提示意义^[16]；其他系统损害以血液最常见，如巨幼红细胞性贫血、血小板减少等，肾脏^[9,17]，骨骼^[9,13]，肝脏等也有病例报道。

已有研究证实cblC病是由于机体内运钴胺蛋白Ⅱ缺陷，肠道吸收维生素B₁₂受限，钴胺素代谢障碍导致MMA和Hcy的堆积引发全身多系统疾病。血液中过多的MMA会通过引起线粒体功能损伤、神经元凋亡、氧化应激、兴奋性毒性、神经细胞骨架磷酸化等途径导致机体多系统多脏器损害^[18]。血清中Hcy浓度的升高会通过磷酸化障碍、血管氧化应激及炎症、能量代谢障碍、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体的过度激活、神经元凋亡和DNA损伤等途径导致神经、血管等多器官组织的功能障碍^[19]，从而产生广泛的临床症状。智能减退是晚发型cblC的常见症状，与体内高Hcy导致神经元细胞坏死或凋亡有关^[20]；癫痫发作可能与NMDA受体的过度激活、γ-氨基丁酸能神经元功能的减退及大脑皮质谷氨酸脱羧酶的抑制^[21]有关；下肢损害为著神经纤维病变与血清高Hcy水平导致有髓神经纤维出现髓鞘脱失、轴突肿胀、间质水肿等改变有关^[22]。

MMA的治疗原则是减少代谢毒物的生成及加速其清除。目前主要的治疗药物有：①维生素B₁₂增加突变酶蛋白的活性，同时有助于增加辅酶的合成；②甜菜碱、叶酸作为甲基供体，激活Hcy重甲基化的旁路途径；③维生素B₆提供Hcy转硫化的辅酶；④左旋肉碱预防肉碱缺乏，并促进有毒代谢物的排泄。多数学者认为，维生素B₁₂的给药类型羟钴胺优于氰钴胺，给药途径肌肉或皮下注射优于口服，本研究也支持这一观点，患者先予羟钴胺肌肉注射治疗，异常代谢指标明显降低，后改为口服维持。关于是否限制天然蛋白摄入尚未达成共识，因患者自身蛋氨酸合成障碍，特殊饮食限制可能进一步加重蛋氨酸缺乏，本研究治疗早期先限制蛋白摄入，半年后鼓励天然饮食。MMA的长期预后是由疾病分型、发病年龄、诊治时间、治疗依从性和有效度共同决定的。晚发病例及早诊治疗尤其重要，可减慢疾病进展，甚至可以完全逆转神经系统的损害。本研究中4例患儿均有智能减退，但经治疗显著改善，考虑与治疗后患者的Hcy水平下降，解除了神经毒性，使皮质神经元功能恢复有关。4例患儿均遗留行走困难，姿势步态异常，与其他报道结果相符^[23,24]，可能与下肢神经纤维走行较长，能量代谢障碍及氧化应激等易受累有关。有关视神经损害的报道罕见，发病机制和治疗效果有待进一步探讨。

综上所述，MMA是一组致病基因繁多，临床变异性高，个体差异较大而又具有可治性的遗传代谢病。晚发型cblC型早期诊断与治疗至关重要，应用基因捕获联合高通量测序技术可以快速诊断该病，维生素B₁₂、叶酸、甜菜碱、维生素B₆及左旋肉碱联合治疗可有效改善患者临床表现及血尿生化异常，预后取决于疾病类型、早期诊断及长期治疗。

 

 

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24. 韩连书，叶军，等．甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸尿症患者治疗效果分析[J]．中华儿科杂志，2013，51：194-198．

 

 

 

图1.家系1中患病姐姐头颅MRI T2轴位，T1矢状位可见脑萎缩，双侧脑室旁轻度脱髓改变（A）。患病妹妹眼底彩色成像可见双侧视神经盘苍白萎缩（B）。患病妹妹腓肠神经活检半薄切片可见大直径有髓神经纤维减少，薄髓纤维增多，有再生簇样结构（箭头），提示慢性轴索病变。甲苯胺蓝 X 400(C)。

 

 

图2. 家系2中患病哥哥头颅MRI T1 T2轴位T2矢状位可见脑萎缩(图2A)。腓肠神经活检半薄切片可见大直径有髓神经纤维减少，薄髓纤维增多，有再生簇样结构（右上箭头），可见不典型“洋葱球样”结构（左下箭头），提示髓鞘和轴索混合性病变，甲苯胺蓝X 400（图2B）。电镜示不典型“洋葱球样”结构，铅-铀双染色 (C)。

 

 

图3.家系1 MMACHC基因测序结果。父亲携带c.482G>A（p.R161Q）突变(A₁)，c.615C位点正常(A₂)；患病姐（B₁,B₂）妹(C₁,C₂)发现复合杂合突变c.482G>A（p.R161Q）（B₁,C₁）和c.615C>A(p.Y205X)（B₂,C₂）；母亲c.482G位点正常（D₁），携带c.615C>A(p.Y205X)突变(D₂)。

 

 

图4.家系2 MMACHC基因测序结果。父亲携带c.482G>A（p.R161Q）突变(A₁)，c.440_441位点正常(A₂)；患病的兄(B₁,B₂) 妹（C₁,C₂）发现复合杂合突变c.482G>A（p.R161Q）（B₁,C₁）和c.440_441del (p.G147fs)（B₂,C₂）；母亲c.482G位点正常（D₁），携带和c.482G>A c.440_441del(p.G147fs)突变(D₂)。