参杞补阳合剂质量控制标准研究

李丽萍，张杜娟，孙京海

（济南市妇幼保健院，山东济南 250001）

摘要：目的：建立参杞补阳合剂的质量标准。方法：采用薄层色谱法对菟丝子、淫羊藿苷进行定性鉴别。采用高效液相色谱法测定淫羊藿苷的含量。结果：菟丝子、淫羊藿苷薄层鉴别色谱斑点清晰，且阴性对照无干扰。含量测定中淫羊藿苷在4.44~35.52μg/ml范围内呈良好的线性关系（r=0.9999）平均回收率99.74%，RSD1.27%。结论: 本法简便、可靠、专属性强，可以作为参杞补阳合剂的质量控制标准。

关键词：参杞补阳合剂；菟丝子；淫羊藿苷；高效液相色谱法; 薄层色谱法

Quality Standard for Shenqi Buyang Mixture

Liping Li, Dujuan Zhang, Jinghai Sun

(Jinan maternity and child care hospital, Jinan 250001)

Abstract: Objective: To establish a quality standard for Shenqi Buyang Mixture． Methods: TLC was used to identify Icariin and Semen Cuscutae，and HPLC was adopted to determine Icariin．Results: TLC spottings were clear，and the negative control had no a interference． The Icariin had a good linear relation between 4.44~35.52μg/ml(r=0.9999) in the content determination，and the average recovery was 99.74% (RSD1.27%)． Conclusion: The method is simple，reliable，with strong exclusive feature，which can be used as the quality control for Shenqi Buyang Mixture．

Keywords: Shenqi Buyang Mixture; Semen Cuscutae; Icariin; HPLC; TLC

参杞补阳合剂为济南市妇幼保健院自制中药制剂，由仙茅、淫羊藿、菟丝子、枸杞子等十四味中药组成。全方具有补肾益精的作用，主要用于治疗男性不孕，精子过少，死精等症，临床疗效显著，该制剂现行质量标准没有定量控制。因此，为了提高产品的质量控制水平，确保其临床疗效，根据山东省食品药品监督管理局医疗机构制剂标准提高研究课题任务书的要求，增加淫羊藿苷，菟丝子的薄层鉴别，以及淫羊藿苷的HPLC法含量测定。

1 材料

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪；Metter Toledo AL104电子天平；KQ-300DE医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药品

淫羊藿苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110737-201516）；参杞补阳合剂（批号20160720x、20160722s、20160724s）；乙腈（色谱纯），甲醇，乙醇（分析纯），水为超纯水。

2 方法与结果

2.1淫羊藿的TLC鉴别

2.1.1试液的制备

取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液，点样量为10µl；取参杞补阳合剂20ml加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液，点样量为20µl；取处方中除去淫羊藿的其他药材，按处方比例制成缺淫羊藿的阴性对照样品，取阴性对照样品20ml，同供试品溶液的制法，制成阴性对照溶液，点样量为20µl。

2.1.2薄层色谱条件

照薄层色谱法(《中国药典》2015 年版一部附录Ⅵ B^[1]) 试验，分别将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液点于同一预制硅胶H薄层板（10×20cm）上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13）为展开剂，上行展开，展距为12cm，取出，晾干，喷1%的三氯化铝乙醇溶液显色，于105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。

2.1.3结果

供试品色谱中，在与淫羊藿苷对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点；阴性对照在相应位置没有斑点，表明阴性对照无干扰。结果色谱图中均斑点清晰、分离效果较好，见图1，故列入标准正文。

图1淫羊藿苷的薄层色谱图（紫外）

1.淫羊藿苷对照品2.供试品20160720x 3.供试品20160722s 4.供试品20160724s 5.阴性对照

2.2菟丝子的TLC鉴别 

2.2.1试液的制备

取菟丝子对照药材0.5g，加水40ml，煎煮半小时，放冷，滤过，取滤液同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液，点样量为10µl；取参杞补阳合剂40ml，置分液漏斗中，用40ml石油醚（30-60℃）振摇提取，弃去石油醚液，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液，点样量为10µl；取处方中除去菟丝子的其他药味，按处方比例制成缺菟丝子的阴性对照样品，取阴性对照样品40ml，同供试品溶液的制法，制成阴性对照溶液，点样量为10µl。

2.2.2薄层色谱条件

分别将对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液点于同一预制硅胶G薄层板（10×20cm）上，以乙酸乙酯-甲醇-水（20∶2∶3）为展开剂，上行展开，展距为8cm，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。

2.2.3结果

供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照在相应位置没有斑点，表明阴性对照无干扰。比较不同薄层板，结果色谱图中均斑点清晰、分离效果较好，见图2，故列入标准正文。 

图2菟丝子的薄层色谱图

1.菟丝子对照药材2.阴性对照3.供试品20160720x4.供试品20160722s5.供试品20160724s

2.3淫羊藿苷的含量测定

2.3.1色谱条件

Kromasil C18色谱柱（4.6×250mm，5μm）；以乙睛-水（30∶70）为流动相^[2]；流速：1.0 ml/min；检测波长：270nm；柱温：30℃；进样量：10μl。

2.3.2 溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取淫羊藿苷对照品（批号：110737-201516）11.1mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度作为对照品储备液，取1ml储备液置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得浓度为17.76μg/ml的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取参杞补阳合剂3.0ml，至10ml量瓶中，加入乙醇至刻度，摇匀，过滤，即得。 

阴性对照溶液的制备：取处方中除去淫羊藿的其他药味，按处方比例制成缺淫羊藿阴性对照样品，照供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.3.3 系统适用性与专属性试验

分别精密吸取淫羊藿苷对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μl，，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图3。由图1 可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以淫羊藿苷峰计≥4 000，保留时间为8.388 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图3系统适用性与专属性试验图谱

A.淫羊藿苷对照品溶液 B. 供试品溶液C.阴性对照溶液

2.3.4.线性关系的考察

分别精密吸取上述对照品溶液各2.5μl、5μl、7.5μl、10μl、15μl、20μl，注入液相色谱仪，分别测定峰面积积分值。以淫羊藿苷对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归。回归方程y = 35234x -1073.1，相关系数r=0.9999。结果表明，淫羊藿苷在4.44~35.52μg/ml范围内线性关系良好。

2.3.5.仪器精密度试验

精密吸取淫羊藿苷对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，测其峰面积。结果淫羊藿苷对照品色谱峰的RSD 为0. 50%，表明仪器精密度良好。 

2.3.6样品稳定性试验

取供试品溶液适量，分别于室温放置0、2、4、8、16、24h后按“2.3.1”项下进样测定淫羊藿苷峰面积。结果淫羊藿苷峰面积值RSD为 0. 87%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.7重复性试验                                                                      

取同一批号样品适量，照“2.3.2”项下制备供试品溶液，平行制备6份，分别按“2.3.1”项下进样测定。结果淫羊藿苷平均含量为0.05699 mg/ml，RSD为2.61%，表明此方法重复性良好。

2.3.8耐用性试验

使用三种色谱柱：Kromasil C18；5μm；4.6×250mm； Thermo ODS HYPERSIL C18；5μm；200×4.6mm；依利特HYPERSIL ODS C18；5μm；250×4.6mm，按上述色谱条件进行测试，结果见表1。结果表明，淫羊藿苷色谱峰的峰型较好，试验条件适用范围广。

表1 色谱柱的考察结果

2.3.9加样回收率试验 

供试品溶液的制备：取已测知含量的本品适量（批号：20160722s，淫羊藿苷含量为0.057mg/ml），取约1. 5ml，精密量取，置10ml容量瓶中，加乙醇约3ml，摇匀。精密量取“2.3.2”项下淫羊藿苷对照品储备液2ml，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解，定容至10ml，即得0.0888mg/ml的对照品溶液。取对照品溶液（浓度为：0.0888mg/ml）1ml于上述10ml容量瓶中，定容，摇匀，过滤即得，平行制备6份。

分别精密吸取“2.3.2”项下的对照品溶液10μl及制得的供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算。结果见表2。

表2加样回收率考察结果

试验结果表明，测定方法的回收率良好。

2.3.10样品测定 

精密量取3 批次样品，按“2. 3. 2”制备供试品溶液，同时吸取对照品溶液和供试品溶液，分别按“2.3.1”项下进样测定，采用对照品比较法计算含量，结果见表3。根据3批样品的含量测定结果，暂定本品每1ml含淫羊藿以淫羊藿苷（C33H40O15）计，不得少于30μg。

表3淫羊藿苷含量测定结果

3.讨论

本文分别对含量测定中制备供试液的提取溶剂、提取方法、取样量进行了筛选考察，以确定最优供试品溶液制备方法。 

3.1提取溶剂的考察

笔者参考2015 年版《中国药典》（一部）^[1]和相关文献^[3-8]中的溶剂，选择乙酸乙酯+甲醇、乙酸乙酯+乙醇、甲醇、乙醇、70%甲醇、70％乙醇作为提取溶剂，分别考察各提取溶剂提取后的测定结果。

精密量取本品（批号：20160722s ）10ml，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次15ml,合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10ml容量瓶中；同法用乙酸乙酯提取后，残渣用乙醇溶解并转移至10ml容量瓶中；精密量取本品（批号：20160722s ）3.0ml，至10ml量瓶中，分别加入甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇至刻度，摇匀，过滤。 分别测定所得供试品溶液的含量。结果见表2。

表2 提取溶剂考察结果

由测定结果可知，用乙酸乙酯振摇提取后，含量明显偏低，直接用甲醇或乙醇处理含量测定结果相当，但含水溶剂中杂质较多，影响柱效，分离效果较差，且溶剂峰过大，故确定以乙醇作为提取溶剂。

3.2提取方法的考察。

精密量取本品（批号：20160722s ）3.0ml，至10ml量瓶中，分别加入乙醇至刻度，摇匀，分别不超声、超声处理10min、30min^[9]，含量测定结果分别为0.057 mg/ml、0.058 mg/ml、0.057 mg/ml。可知，各方法结果相当。故为了节省能源，确定提取方法为不用超声提取。

3.3取样量的考察

分别精密量取本品（批号：20160722s）2.0ml 、3.0ml、4.0ml，至10ml量瓶中，各加入乙醇至刻度，摇匀，过滤，测定含量。含量测定结果分别为0.057 mg/ml、0.058 mg/ml、0.058 mg/ml。确定取样量为3ml。

综上所述，本研究方法操作简单易行，结果准确、重现性好、专属性强，可作为参杞补养合剂的质量控制方法。

参考文献：

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