兔膝关节骨性关节炎模型的建立和研究

摘要：

目的  制作兔膝关节骨性关节炎的模型，并且通过观察软骨组织及软骨细胞退变情况进行分析和研究。

方法  取健康雌性新西兰兔,30只，体重2.0-3.0kg，随机分为两组，石膏组和手术组，每组15只，取兔右后肢膝关节内侧纵行切口切断前后交叉韧带和内侧副韧带并切除内侧半月板，逐层缝合伤口。术后每日肌肉注射青霉素2ⅹ10⁵U，连续注射3天，预防手术切口感染。12周后处死全部动物，取完整膝关节作为实验标本。

结果和结论  通过石膏固定和手术有创操作可以成功建造膝关节骨性关节炎的动物模型。

关键词：膝关节骨性关节炎；动物模型；兔子；软骨。

Abstract

OBJECTIVE:To establish the model of rabbit knee osteoarthritis,we need to analyze and study the degeneration of cartilage tissue and chondrocytes.

METHODS: 30 healthy female New Zealand rabbitswere taked,2.0-3.0 kg weight,they were randomly divided into two groups,the plaster and the surgery group,each group of 15 omly,longitudinal incision was made on the medial knee joint of the right posterior limb of the rabbit, and then cut the anterior and posterior cruciate ligments and the medial collateral ligament,remove the medial meniscus,suture the wound layer by layer.2ⅹ10⁵U Penicillin was intramuscularly injected daily after the surgery for 3 days,this procedure is to prevent infection of the wound.All animals were killed after 12 weeks,complete knee joint was taken as experimental specimen.

RESULTS AND CONCLUSION:Animal models of osteoarthritis of the knee joint can be successfully constructed by plaster fixation and invasive surgical procedures.

KEY WORDS: osteoarthritis of the knee join,Animal models, rabbit,cartilage.

膝关节骨性关节炎是一种常见的老年性关节疾病，以关节软骨的退变性改变为核心，累及骨质、滑膜、关节及其他结构的改变。目前对这一疾病的发病机制和治疗方法均不明确，因此，建立膝关节骨性关节炎的动物模型就可以为人类进一步研究其发病和治疗提供重要的前期基础，因此具有重大的科研和临床意义。汤晓晨^[1]等人利用有创的方法建模，术后主动驱赶兔子活动，从而引起膝关节的骨性关节炎模型。戴七一等人^[2]创新了建模方法，使用结扎并切断同侧的臀下静脉、股静脉和大隐静脉，造成膝关节周围骨内持续高压，从而引起膝关节骨性关节炎。刘署彬等人^[3]也使用了阻断血流引起膝关节高压的方法，但是主要阻断的是髓内血流，与戴七一的髓外血流阻断有所不同，但是都取得了满意的试验结果。张君涛等人^[4]则对各种建模方法进行深入细致的分析，让我们看到了不同建模方法的优劣。

1  材料和方法

1.1 实验动物及分组

健康雌性家兔30只，体重2.0-3.0kg，标准饲料喂养。随机分为两组，石膏组合手术组，每组15只，动物由海军医学院动物中心提供。每组动物均采用2%的戊巴比妥钠（1.5ml/kg）耳源静脉注射，麻醉显效后兔子置于仰卧位。

1.2 动物模型

石膏组：取新西兰白兔右后肢膝关节周围用棉垫包裹，然后用高分子石膏管型固定于伸直位，长度从股骨上端至膝关节下方2cm，待石膏定型固定后放入兔笼继续喂养。

手术组：同样取新西兰白兔右后肢膝关节内侧纵行切口，切断前后交叉韧带和内侧副韧带，并切除内侧半月板，术中行侧方应力实验和前后抽屉实验来确定手术操作成功，然后生理盐水冲洗，逐层缝合伤口，术后每日肌肉注射青霉素2ⅹ10⁵U，连续三天预防感染。

造模12周后，静脉麻醉，解剖右后肢膝关节，观察关节软骨的大体变化，然后加大麻醉药剂量处死全部动物。

1.3 取材

光镜标本：使用手术刀片和锋利的手术剪刀取膝关节内侧胫骨平台的软骨组织，然后放入4%的多聚甲醛溶液中固定，脱钙，脱水，石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察。

1.4  观察指标

1）肉眼观察：对新鲜标本进行肉眼下大体观察；2）光镜下观察：标本行HE染色、番红O染色，光镜下对其结构进行仔细观察，参考Mankin评分表；3）电镜下观察：常规标本电镜制片染色后，投射电镜下观察各组超微结构。

骨性关节炎组织病理学分级评分，参照Mankin表中的结构、细胞及潮线的完整性来评分。

骨性关节炎组织病理学分析评分Mankin评分表（满分10分）：

1.4 统计学分析

各组Mankin评分，均采用均数+标准差来表示，采用SPSS13.0统计软件进行统计，组间比较采用q检验，以p＜0.05视为差异有统计学差异。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 实验中手术组动物死亡3只，2只因为静脉麻醉过深呼吸抑制而死亡，1只因为术后伤口感染而死亡。石膏组动物死亡3只，1只因为静脉麻醉过深呼吸抑制而死亡，2只因为石膏包扎过紧造成肢体干性坏疽而死亡。排除死亡兔子，进入分析的实验对象共24只。

2.2 肉眼观察

石膏组和手术组均可见关节囊明显增厚，关节液黄色浑浊，量较多，关节软骨呈现灰黄色，软骨表面不光滑，局部出现溃疡，石膏组可见关节边缘明显的骨赘，手术组与此相同。

2.3 光镜观察

石膏组和手术组均可见在浅表区粗糙或有明显炎性肿胀，产生裂隙，深达辐射区，深层细胞数目异常，表现为细胞数目减少或簇集，番红O染色中、重度减弱，潮线模糊。

石膏组                       手术组                      正常组

2.4  各组病理学评分

手术组和石膏组分别与正常组对比，均p＜0.05，视为有统计学差异。手术组和石膏组对比，p＞0.05，视为无统计学差异。

3   讨论

3.1   两种OA建模方法的对比

在兔子膝关节骨性关节炎的建模方法上，本实验采用了石膏固定一侧肢体和手术切除半月板的方法，两种方法都简单易行，但是石膏组的兔子因为没有有创伤口的存在，感染而死亡的风险很低，也无需再术后注射青霉素，但是对石膏固定的技术要求较高，既不能包裹太紧引起肢体缺血坏死，也不能包裹太松，从而需要二次石膏固定。手术有创建模需要切断内侧副韧带及前后交叉韧带，同时切除半月板，术后可造成膝关节不稳定，兔子行走过程中，胫骨平台内侧受力过大，从而引起膝关节骨关节炎。

石膏组和手术组在OA模型建立上都是成功的，在试验结果中可以看到Mankin评分明显高于正常，同时肉眼观察和光镜下观察，也都有明确的差异。两种建模方法本身的对比上，无明显差异，也就意味着两种方法都可以作为膝关节炎动物模型建模的方法，可根据具体需要进行选择。

3.2    建模过程中需要注意的地方

在膝关节骨性关节炎的动物模型建立过程中需要注意以下几点：第一，麻醉过程中，一定要根据兔子体重严格掌握麻醉药的剂量，否则麻醉药剂量过大会引起呼吸抑制而死亡，本试验中有3只兔子因为麻醉药的过量死亡。第二，石膏固定建模时，需要在石膏内部加棉垫，而且包扎要松紧适度，过紧容易引起坏疽，过松容易导致脱落，都不利于试验的进行。第三，手术建模的操作过程中要尽量注意无菌操作，避免感染，术后要加强伤口换药，同时注射青霉素，否则容易伤口感染导致死亡。第四，动物养殖的笼子要定期消毒，保持恒温，一兔一笼，避免相互咬伤和呼吸道感染死亡。

    人类的膝关节骨性关节炎的具体致病原因及过程，尚未完全研究清楚，具体的治疗方案何种有效，也需要不断的试验。科学研究的过程中，动物模型的建立是必不可少的，本试验的两种建模方法操作相对简单，可重复性强，能够为后续探索和治疗提供可靠的动物模型。

参考文献：

1  汤晓晨，俞峰等.兔膝关节骨性关节炎动物模型的复制与评价。南京中医药大学学报2014年9月第30卷第5期.

2  戴七一，覃学流等.兔骨内高压型膝关节骨性关节炎模型的建立.中国组织工程研究与临床康复第15卷第20期.

3  刘署彬，孔祥星等.股骨干骺端髓内血运阻断诱发兔膝关节骨性关节炎模型.中国矫形外科杂志2003年12月第11卷第24期.

4 张君涛，吴超超等.膝关节骨性关节炎动物模型研究进展.重庆医学2018年5月第47卷第15期.