小儿化滞健脾丸对小儿厌食症模型大鼠组织MTL、CCK8和β-EP表达的影响

赵林涛¹，高 凯²，高茂煌³，刘铁明³，宋延平^*

（1.陕西省中医药研究院 药理研究室，西安 710003；2.陕西中医药大学，咸阳 712046；3.西安正大制药有限公司，西安 710043）

摘要  

目的：采用幼龄厌食症模型大鼠，评价小儿化滞健脾丸的治疗作用，并探讨其对模型大鼠下丘脑中CCK8、β-EP及胃窦组织中MTL等的影响。

方法：将72只SD幼年大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性组、小儿化滞健脾丸高、中、低剂量组，每组12只。用特制饲料喂养法构建小儿厌食症模型，给药四周，监测体重和摄食量等一般状态。末次完成给药后，测定其小肠推进率；并采用免疫组化法检测组织中MTL、CCK8和β-EP的表达情况。

结果：与模型组比较，各治疗组大鼠的进食量、体重、小肠推进率等均显著增加（P < 0.01或P < 0.05），阳性组、大、中剂量组胃窦组织中MTL蛋白表达显著增高，阳性组、大剂量组下丘脑中β-EP蛋白表达显著增高，阳性组、大、中剂量组CCK8蛋白表达显著降低。

结论：小儿化滞健脾丸可以有效改善小儿厌食模型的厌食症状，提示该药对小儿厌食症有较好的治疗作用，其作用机理可能为通过调节MTL、β-EP、CCK8等的表达，即调节“脑肠肽-食欲中枢”来实现其治疗作用。

关键词　小儿化滞健脾丸；小儿厌食症；免疫组化；MTL；β-EP；CCK8

Effect of Xiaoer Huazhi Jianpi Pill on expression of MTL, CCK8 and β-EP in young rats with anorexia model

ZHAO Lin-tao¹, GAO Kai², GAO Mao-huang³, LIU Tie-ming³, SONG Yan-ping^1*

(1. Pharmacology Laboratory, Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine, Xi'an 710003, China; 2. Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046, China; 3. Xi'an C.P. Pharmaceutical Co., Ltd., Xi'an 710043, China)

Abstract: Objective: The young rats with anorexia were used to evaluate the therapeutic effect of Xiaoer Huazhi Jianpi Pill and its effects on CCK8, β-EP and MTL in model rats. Method: The model of anorexia in children was constructed by special feed feeding method, and the body weight and food intake was monitored . After the last administration, the small intestinal propulsion rate was measured; and the expression of MTL, CCK8 and β-EP in tissues was detected by immunohistochemistry. Results: Compared with the model group, the food intake, body weight, and small bowel propulsion rate of the rats in each treatment group increased significantly. The expression of MTL in the gastric antrum tissues of the positive, high and middle dose groups was significantly increased. The expression of β-EP in the hypothalamus of the positive group and the high dose group was significantly increased, and the expression of CCK8 in the positive group and the high and middle dose groups was significantly decreased. Conclusion: Xiaoer Huazhi Jianpi Pill can effectively improve the anorexia symptoms in children with anorexia model, suggesting that the drug has a good therapeutic effect on anorexia in children. The mechanism may be through regulation of MTL, β-EP, CCK8, etc. that is, regulating the “brain-intestinal peptide-appetite center”, to achieve its therapeutic effect.

Key words: Xiaoer Huazhi Jianpi Pill; anorexia of children; immunochemistry; MTL; β-EP; CCK8

小儿厌食症是以多种原因引起的小儿（主要是3 - 6岁）较长期食欲减退或食欲缺乏为主的症状，又称消化功能紊乱，是一种常见的儿科病症^[1]。若患儿食欲长期得不到改善，可导致小儿营养不良、贫血、佝偻病、甚至免疫功能低下等，其严重影响着儿童的生长发育，已引起国内外医学界的高度重视^[2]。小儿化滞健脾丸，由白术、酒白芍、六神曲、莲子、泽泻、炒鸡内金、麸炒山药、茯苓、炙甘草、炒山楂、麸炒芡实、使君子、陈皮等组成，具有健脾消食的功能，用于宿食不消、不思饮食、面黄肌瘦、腹痛胀满、呕吐便溏等症。通过多年的临床观察，认为其治疗小儿厌食症具有可靠疗效。本研究采用特制高脂饲料喂养建立幼龄厌食大鼠模型，观察小儿化滞健脾丸对模型大鼠胃肠动力、胃窦组织MTL、下丘脑CCK8和β-EP等指标的影响，以期为小儿化滞健脾丸临床治疗小儿厌食症提供药理学依据，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法：

1.1 实验动物与饲料 SPF级SD幼龄大鼠，雌雄各半，体质量50 - 60g，共72只。由西安交通大学医学院实验动物中心提供，合格证号：61001700002598，许可证：SCXK(陕)2017-003。常规饲料由上述单位提供；造模期间所用特制饲料自制，方法^[3-5]为将鲜猪油、奶粉、鱼肉松、白砂糖、鲜鸡蛋、玉米粉、黄豆粉按2:1:1:1:1.8:1:2的比例配制混匀^[8]，手工捏成饼干状，平均每块特制饼干重20g左右，晾晒后，避湿冷藏。

1.2 药物及剂量 （1）受试药物：小儿化滞健脾丸，由西安正大制药有限公司提供，批号：170601；（2）阳性药物：多潘立酮片，由西安杨森制药有限公司生产，批号：180301117；（3）剂量设置：小儿化滞健脾丸，根据5 - 9岁儿童体重（约25 kg）比例计算临床用量为0.184 g·kg^-1，大鼠药效小、中、大剂量为0.736、1.472、2.944 g·kg^-1（配制浓度约为0.075、0.15、0.30 g·mL^-1），约为临床剂量的4、8、16倍。阳性药多潘立酮片配制浓度为0.02 g·mL^-1。给药体积均为10 mL·kg^-1。

1.3 试剂与仪器 SABC免疫组化染色试剂盒（货号：SA1022），DAB显色试剂盒（货号：AR1022）,武汉博士德生物工程有限公司；胃动素（MTL）多克隆抗体（货号：ICP575Ra01）,上海联迈生物工程有限公司；CCK8多克隆抗体（货号：orb10260）,博欧特生物科技有限公司；β-EP单克隆抗体（货号：ab54205）,艾博抗贸易有限公司。BAS 224S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DH 4000B Ⅱ电热恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；BI – 2000图像分析系统，成都泰盟软件有限公司；E200正置显微镜，上海尼康仪器有限公司。

1.4 造模方法 将72只幼龄SD大鼠随机分为空白对照组与模型组。空白对照组12只，模型组60只，每组雌雄各半。空白对照组喂食常规饲料，模型组喂食特制饲料，造模三周。模型组大鼠食量下降明显，模型组摄食量低于空白对照组的30% - 50%，体重降低10% - 15%，造模期间没有拱背、腹泻、倦卧等显著脾虚症状，认定为造模成功^[6,7]。每日定时记录大鼠食量和体重，并观察造模大鼠毛色是否正常、情绪及活动是否激动暴躁。

1.5 动物分组及治疗 造模后，模型组按照体重梯度重新分组，分为模型组、阳性药组、受试药大、中、小剂量组，每组12只，雌雄各半。每日定时进行灌胃，空白对照组与模型组同时灌胃生理盐水。给药第四周结束后进行各项指标检测。

1.6 动物的一般生理性指标观察 观察实验过程中各组大鼠体重、食量、毛色、情绪及活动变化情况。每日上午在固定时段给大鼠投食，记录投放食物的重量，次日上午在同一时段称量前一天投放所剩食量并记录。记录摄食量后依次给每组大鼠称重，必要时加深大鼠号码标记，以免出现数据误差。

实验动物摄食量等于投放食量与剩余食量之差。

1.7 小肠推进率测定 末次给药后，禁食24 h，禁食期间大鼠自由饮水。禁食24 h后，大鼠均灌胃营养性半固体糊2 mL/只。灌胃60 min后处死，迅速将小肠取出后，轻轻将小肠剥离，不得用力拉伸，置于桌上（桌面上铺白纸，以免测量出现误差）用尺子量取幽门至半固体营养糊（黑色）前沿处及十二指肠全长（幽门至回盲部）^[8]。

小肠推进率的计算方法为幽门至半固体营养糊前沿处占十二指肠全长的百分率。

营养性半固体糊的配制^[9]：先取羟甲基纤维钠5 g，置于125 mL蒸馏水中溶解后，依次加入全脂奶粉8 g、活性炭2 g、白砂糖4 g、淀粉4 g搅拌均匀，配制成150mL约150g的黑色半固体糊状物，现用现配。

1.8 下丘脑和胃窦组织HE染色

将大鼠处死后，取出下丘脑和胃窦组织于10%福尔马林液固定，常规脱水，石蜡包埋，-20 ℃冷藏后，切片（厚度4 μm）。将切片置于65 ℃烘箱中1 h后进行HE 染色： 二甲苯Ⅰ 15 min、二甲苯Ⅱ 15 min、无水乙醇Ⅰ 5 min、无水乙醇Ⅱ 5 min、95%乙醇Ⅰ 5 min、95%乙醇Ⅱ 5 min、85%乙醇5 min、自来水浸洗1 min；将切片浸入苏木精染液中常温染色5 min，自来水洗1 min；将切片浸入1%盐酸乙醇溶液数秒，自来水冲洗至组织返蓝；将切片浸入伊红染液中染色3 - 5min，自来水洗去玻片上的浮色；85%乙醇0.5 min、95%乙醇Ⅰ 0.5 min、95%乙醇Ⅱ 0.5 min、无水乙醇Ⅰ 0.5 min、无水乙醇Ⅱ 0.5 min、二甲苯Ⅰ 3 min、二甲苯Ⅱ 3 min，取出晾干后用中性树胶封片；显微观察，拍照，进行染色结果分析^[12]。

1.9 免疫组化检测

将石蜡切片于65 ℃烘箱中1 h后，常规脱蜡至水（二甲苯Ⅰ 10 min，二甲苯Ⅱ 10 min，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、85%乙醇和蒸馏水中各3 min，逐级充分水化），严格按照SABC免疫组化染色试剂盒说明书对胃窦组织MTL、下丘脑组织CCK 8、β-EP等指标进行染色。晾干后用中性树胶封片，显微观察，拍照分析^[13,14]。

1.10 统计方法 采用SPSS 23.0软件进行资料的统计分析，正态计量资料用均数±标准差 (x̄±s) 表示，两组间均数比较，采用独立样本t检验；多组间均数比较，采用单因素方差分析；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果：

2.1 一般生理性指标

2.1.1 造模过程动物体重及摄食量变化 适应性喂养两日，第三日开始投食特制饲料，结果见表1、表2。整体摄食量呈增加趋势，体重增值稳定。第4天开始，造模组摄食量开始出现显著性差异（P < 0.05），体重在5天后开始产生显著性差异（P < 0.05）。第10天有部分造模大鼠开始有脱毛迹象，两周后部分大鼠可见地图状毛发，毛色无光泽，情绪浮躁，打斗较激烈。

表1 造模期间体重变化（x̄±s, g）

Table 1 Changes in body weight during modeling (x̄±s, g)

注：与空白对照组比较^*P < 0.05，^**P < 0.01

表2 造模期间摄食量变化（x̄±s, g）

Table 2 Changes in food intake during modeling (x̄±s, g)

 注：与空白对照组比较^*P < 0.05，^**P < 0.01

2.1.2 给药后动物体重及摄食量变化 造模21天后重新分组，第二天开始给药，结果见表3、表4。给药后四周模型组摄食量始终低于空白对照组（P < 0.01），给药第四周，阳性组、大、中、小剂量组摄食量大于模型组（P < 0.01）；从第19天开始，大剂量组大鼠体重明显大于模型组（P < 0.05）；第21天，中剂量组大鼠体重明显大于模型组（P < 0.05）；第23天，小剂量组大鼠体重明显大于模型组（P < 0.05）。阳性组，大、中、小剂量组中的模型动物，严重者几乎全体脱毛，肉眼可见粉色皮肤表层，在给药一周后有明显改善，毛色恢复光泽，与造模时期相比脾性相对稳定，发生打斗等活动为正常行为。

表3 给药后摄食量变化（x̄±s, g）

Table 3 Changes in food intake after administration (x̄±s, g)

注：与模型组比较^*P < 0.05，^**P < 0.01

表4 给药后体重变化（x̄±s, g）

Table 4 Changes in body weight after administration (x̄±s, g)

注：与模型组比较^*P < 0.05，^**P < 0.01

2.2 小肠推进率测定 结果见表5，模型组小肠推进率显著小于与空白对照组（P < 0.01），阳性组、大、中、小剂量组小肠推进率显著大于模型组（P < 0.05，P < 0.01）。

表5小肠推进率（x̄±s）

Table 5 Small intestine propulsion rate (x̄±s)

组别	剂量/g·kg-1	动物数	小肠推进率/%
空白对照组	-	11	70.58±8.16**
模型组	-	11	59.52±6.28
阳性组	0.0125	12	71.86±6.40 备案信息 举报中心 举报中心 行业协会 网络110 互联网协会 举报热线 首都协会 本站持《出版物经营许可证》 仅从事《有色矿冶》杂志的网上订阅工作,非任何杂志官网,并不涉及杂志社的出版等事务,特此声明！ 工信部备案：湘ICP备2025122662号-1，营业执照统一社会信用代码：91430721MAEHMRR7OE， 出版物经营许可证号：新安新出发证字第2025002号 特别声明:本站资料均源于网上的共享期刊资源，请特别注意，勿做其他非法用途。 如有侵犯您的版权或其他有损您利益的行为，请联系指出，期刊咨询服务平台会立即进行改正或删除相关内容! 扫码添加微信咨询 QQ客服：1663286777 电话：137-1883-9017 收到信息将及时回复