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循环microRNAs在乳腺癌中的研究进展
邢翠翠1 付伦
(1金华市中医医院，浙江 金华 321000)
乳腺癌(breast cancer, BC)是女性最常见的恶性肿瘤之一，是导致全球妇女因癌症死亡的主要疾病[1]。全球每年约有120万新发乳腺癌病例，50万死亡病例，在我国每年约有19万新发乳腺癌病例，发病年龄日趋年轻化，发病率逐年上升，严重危害女性健康。现阶段常用的诊断技术包括超声、乳腺钼靶、CT、MRI等都有一定的误诊率，细针穿刺细胞学检查具有损伤性，肿瘤标志物糖类抗原153（CA15-3）的阳性率较低，均限制了其在临床上的实际应用。
microRNA（miRNA）是一类非编码小RNA, 长度约为18-25个核苷酸( nucleotide, nt) (平均约22 nt),主要通过碱基互补配对原则结合靶基因mRNA 的5′ UTR[2-3] 、编码区[4]或3′ UTR，促进mRNA降解或抑制翻译过程，在转录后对基因表达行负调控功能。每个miRNA可能调节数百个靶基因,广泛参与了细胞增殖、凋亡、分化等众多生命活动[5] [6] [7]。
1 循环miRNA的生物学特性
有关miRNA的研究，组织往往是优先被选择的研究对象，但是肿瘤组织标本在临床应用中具有其局限性：或是需手术切除后获得；或是细针穿刺细胞学检查，均属于有创操作，不能为广大患者所接受。miRNA在血液循环中含量丰富，可与argonaute(AGO)蛋白或高密度脂蛋白结合，表达高度稳定，具备成为优质生物标志物的潜质。Köberle 等[8]研究发现miRNA可通过溶血获得，与囊泡相关的miRNA表达更稳定、更能耐受RNA 酶。miRNA在血浆、血清中反复冻融8次、室温静置24 h，然后在加入DNA酶、RNA 酶、强酸、强碱等条件下，其含量仍可保持相对稳定[9] [10]。Chen等[11]利用Solexa技术分别在中国健康女性和男性血清中筛选出100个miRNAs和90个miRNAs，同样获得肺癌、结直肠癌、糖尿病等疾病的特异性表达血清miRNAs，通过qRT-PCR技术验证筛选出的肺癌miRNAs，证明血清miRNAs表达稳定、可再生，具备作为人类多种肿瘤及疾病生物标志物的潜能。miRNAs表达谱在细胞内、外是不同的，Pigati 等[12]研究报道miR-1246由乳腺上皮细胞产生并保存在正常乳腺细胞中，当乳腺上皮细胞发生恶变时，miR-1246会选择性地释放到循环血液中，使循环miR-1246含量升高。此外，循环miRNA在临床应用中具有其独特的优势，即样本采集方便、容易保存、可以反复采取进行动态监测、微创。miRNA 在进化上具有高度保守性、时序性和组织特异性等特点，不同疾病的miRNAs表达谱不同。以上特征均显示了血浆、血清中miRNA作为理想肿瘤标志物的潜质。
2 循环miRNA与肿瘤的发生发展
miRNA的异常表达对细胞信号转导途径的功效有严重影响，导致细胞增殖和分化不受控制，最终导致肿瘤的发生。miRNA已经被证明在肿瘤的发生发展中具有重要作用。Calin等[13]发现50%以上的miRNA基因定位在与肿瘤相关的区域或脆弱位点，首次证明miRNA失调在肿瘤发生中发挥重要作用。Takemizawa等[14]报道了第一个肺癌相关性miRNA:let-7。
循环miRNA的异常表达与多种人类恶性肿瘤密切相关[15]。近年来，研究者们利用血清、血浆对多种癌症进行了研究，相继发现循环miRNA在胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌等肿瘤的表达水平有特异性变化，循环miRNA对于多种肿瘤具有一定的诊断价值。Tsujiura 等[16]对69例胃癌患者和30例健康正常者血浆中miR-17-5p、miR-21、miR-106a、miR-106b和let-7a 的表达水平进行对比，结果发现在胃癌患者血浆中的miR-17-5p、 miR-21、miR-106a、miR-106b均明显增高，而let-7a显著降低 ，当ROC曲线面积下miR-106b 和miR-106a/let-7a 的比值分别为0.721和0.879时，该比值可用于胃癌的诊断。Wang等[17]研究miR -155 、miR-21、miR-210和miR -196a在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)患者血浆中的表达水平，与病例特征相结合，结果发现miR-155在肿瘤形成早期的表达水平显著上调，而miR-196a表达水平的高低与患者病程有关。用这4 个miRNA联合诊断PDAC，其特异度为89%，灵敏度为64%。Resnick等[18]研究报道卵巢癌血清中miR-21、miR-92 、miR-93 表达上调，可作为卵巢癌肿瘤标志物及治疗效果的监测指标。血清miR-885-5p在肝癌中表达升高，是肝癌的新型肿瘤标志物[19]。Ng等[20]通过对5例结肠直肠癌（colorectal cancer ，CRC ）患者和5例健康对照者的组织标本和血浆进行miRNA芯片分析，发现有5个miRNA同时存在上调，其中在小样本的病例研究中提示miR -92和miR-17-3p的含量在CRC患者血浆中显著升高，术后明显降低，而在大样本的研究发现，miR-92能有效地把CRC患者与健康人、胃癌、炎症性肠病患者区别开来，其诊断的灵敏度和特异度分别为为89%和70%。
循环miRNA在不同肿瘤的发生、发展等多个方面扮演着重要角色，可作为肿瘤诊断的生物标志物，对肿瘤具有一定的诊断价值。此外循环miRNA还可以作为个体化治疗指标、预后判断指标，对肿瘤患者进行个体化治疗及疗效监测。
3 循环miRNA在乳腺癌中的表达及意义
miRNA可通过多种方式起作用，有些miRNA表达升高，可以作为癌基因起到促进细胞增殖的作用；有些miRNA作为抑癌基因，在细胞内表达下调，进而抑制细胞凋亡[21]；有些miRNA研究结果显示双向表达，具有争议性；有些miRNA与乳腺癌细胞发生侵袭、转移有关；有些miRNA在乳腺癌不同临床分期中差异表达，对早期乳腺癌诊断具有一定的诊断价值。
3.1 乳腺癌miRNA表达谱
miRNA的表达具有组织特异性，不同肿瘤的miRNA表达谱是不同的[22]，即使同一种肿瘤所选用的研究标本不同、采用方法不同，也会出现差异性结果。之前有多次研究报道了乳腺癌有关miRNA表达谱。van Schooneveld 等[23]利用Taqman低密度芯片（TaqMan low-density arrays ，TLDA）技术在87例乳腺癌组织和8例正常组织中筛选出共768个差异性表达miRNAs，通过非监督等级聚类分析方法（unsupervised hierarchical cluster analysis ，UHCA）得到4个变化最显著的miRNAs：miR-215、miR-299-5p、 miR-411和miR-452，随后采用qRT-PCR检测发现4个miRNAs的表达水平在乳腺癌血清中均有显著性差异，其中在发生转移的乳腺癌患者血清中miR-215、miR-299-5p和miR-411呈差异性表达。Cuk等[24]同样采用TLDA方法在乳腺癌患者和正常者血浆中筛选差异性表达miRNAs，通过qRT-PCR验证得到miR-148b、miR-376c、miR-409-3p 和miR-801在乳腺癌血浆中显著性高表达。Zhu等[25]通过二代高通量测序技术Illumina Hiseq2500对乳腺癌组织、癌旁正常组织、乳腺癌血清、正常对照血清（各8例）进行研究，共筛选出10个血清和组织共同显著性差异表达miRNAs，即miR-132-5p、miR-125b-1-3p、miR-34c-5p、miR-382-3p、miR-485-5p、miR-323b-3p、miR—598-3p、miR-224-5p、miR-1246、miR-184。
在实验研究中通常采用基因芯片或二代高通量测序技术筛选肿瘤差异性表达miRNA，对于乳腺癌，通过不同方法、不同样本可筛选出不同的差异性表达miRNA，以下将介绍一些研究较为深入的miRNA。
3.2 癌基因miRNA
循环miRNA在乳腺癌患者中表达水平升高，促进肿瘤细胞增殖，可起到癌基因作用，因此有研究称之为“oncomirna”。
miR-21作为原癌基因，通过结合抗凋亡基因B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）[26]、抑癌基因程序性细胞死亡因子4（Programmed Cell Death 4，PDCD4）[27]、原肌球蛋白1（tropomyosin 1，TPM1）[28]和第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白（phos -phatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）[29]，抑制乳腺细胞凋亡、促进细胞增殖，参与肿瘤的发生发展。Sota Asaga等[30]采用一种新型检测方法“RT-qPCR直接应用于血清”（ RT-qPCR applied directly in serum，RT-qPCR-DS）对102例乳腺癌患者和20例健康对照者血清的miR-21表达水平进行了检测，发现乳腺癌血清miR-21显著性高表达，且高水平miR-21与AJCC分期、乳腺癌血管转移以及淋巴结转移具有显著相关性，与ER和年龄无关。
Wang等[31]对PubMed等几大数据库的有关循环miR-155的研究(截止到2014年1月30日)作了meta分析，得出结论：循环miR-155对乳腺癌的敏感度和特异性分别为79% (95% CI：72%-84%) 、85% (95% CI: 75%-92%)，诊断效率较高。Wang等[32]对miR-155在68例乳腺癌患者和40例健康对照者血清中的表达水平进行比较，发现在乳腺癌患者血清中miR-155的含量明显上调，并与乳腺癌患者的临床病理指标如组织学肿瘤分级和女性激素受体状态相关。血清miR-155不仅可作为乳腺癌诊断的肿瘤标志物，其表达水平在乳腺癌患者经过手术、化疗等治疗后也会随之下降，因此还可作为乳腺癌疗效监测指标[33]。Zhu 等[34]通过对miR-155在乳腺癌患者血清中的表达水平进行小样本研究，发现miR-155在乳腺癌患者和非乳腺癌患者血清中的表达无显著性差异，但其含量在孕酮受体阳性的癌组织患者中要高于阴性患者，提示其可能不是乳腺癌的诊断指标，但对患者病程或预后的相关信息有望提示。另外，miR-155还可通过抑制RAD51调控DNA修复活性，加强乳腺癌患者对放疗的敏感性，提高患者的生存期[35]。
据报道，在不同肿瘤中miR-125b既可作为癌基因又可作为抑癌基因。在乳
腺癌中miR-125b作为癌基因，通过抑制Bcl-2拮抗剂1（Bcl-2 antagonist killer 1 ，Bak1)促进乳腺的发生发展[36]。Wang等[37]研究报道miR-125b在乳腺癌患者血清中高表达，可以耐受抗癌药物，与乳腺癌患者对化疗不敏感有关，这为乳腺癌的个体化治疗提供了新的思路。
Sochor等研究发现了一组乳腺血清原癌基因miRNAs：miR-155、miR-19a、miR-181b和 miR-24，它们在乳腺癌血清中高表达，在术后乳腺癌血清的表达降低，提示可以作为乳腺诊断的肿瘤标志物及术后预后判断指标。
3.3 抑癌基因miRNA
循环miRNA在乳腺癌患者中表达下降，可通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖，发挥抑癌基因作用。
miR-145是许多肿瘤的抑癌基因，通过结合原癌基因N-RAS、血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）在转录后水平抑制乳腺癌血管再生、细胞生长、侵袭以及乳腺癌发展[38]。Sachdeva等[39]在人乳腺癌细胞株 MCF-7 中研究发现：miR-145通过抑制黏蛋白1（mucin 1 ，MUC1）的表达，引起beta-catenin和cadherin 11表达减少，导致乳腺癌细胞侵袭、转移能力下降。Ng等[40]分别先后对95例乳腺癌患者血浆和100例正常对照者血浆、70例乳腺癌和50例健康血浆进行了筛选、验证，共发现1个下调的miR-145和其它8个上调的miRNAs，miR-145对乳腺癌诊断的AUC为0.631。Mar-Aguilar F等[41]的研究结果与其相反，采用qRT-PCR探针技术对61例乳腺癌患者血清和10例正常对照者血清的miR-145表达水平进行研究，发现miR-145在乳腺癌血清的表达水平显著增高，对乳腺癌诊断的AUC为0.9777，敏感度和特异性分别为94.40%、100%，诊断效能较高。
Guo等[42]首次研究报道发现miR-181a在乳腺癌血清中呈低表达，其表达水平与乳腺癌患者的临床病理指标无相关性，对乳腺癌诊断的敏感度和特异性分别为70.7%、59.9%，可作为早期乳腺癌诊断的肿瘤标志物。
Zeng等[43]对100例乳腺癌患者和64例健康正常者血浆中的miR-30a检测，发现miR-30a在乳腺癌患者血浆中表达水平降低，对乳腺癌诊断的敏感度和特异性分别为74.0%、65.6%，其表达与ER状态具有相关性（P=0.007）。
3.4 双向调控miRNA
根据不同的研究报道，某些循环miRNA在乳腺癌患者中表达水平升高或下
降，结论具有争议性。
miR-195-5p可作为抑癌基因，通过结合Cyclin E1（CCNE1）[44]、Cyclin D1
（CCND1）[45]，影响细胞周期由G1期向S期过渡，引起G1期阻滞，抑制乳腺
癌细胞增殖和集落形成能力，还可通过加强 原癌基因Raf-1[45]作用发挥抑癌功
能。miR-195还可作为癌基因促进乳腺癌的发生发展。Zhao 等[46]利用以SYBR
Green为基础的qRT-PCR检测了102例乳腺癌患者和正常者血清miR-195表达水
平，发现血清miR-195在乳腺癌患者中下调，对乳腺癌诊断的敏感度和特异性分
别为69.0%、89.2%，miR-195对早期乳腺癌（DCIS、TNMⅠ、Ⅱ）诊断敏感度
为73.97%，乳腺癌患者经过新辅助化疗后其表达水平升高2倍以上，miR-195
可作为乳腺癌尤其早期乳腺癌诊断的肿瘤标志物以及疗效监测指标。Heneghan
等[47]选了与乳腺癌相关的7 个miRNA，将其在乳腺癌患者的肿瘤组织和血浆的
含量进行研究，结果发现乳腺癌患者组织中检测到癌症特异性miRNAs并显著
改变，在血浆中的含量均高于正常。而且还与临床病理学变量相关，即淋巴结状
态和ER状态。
miR-382在乳腺癌中的表达具有双向性。Mar-Aguilar等[48]研究表明miR-382
在乳腺癌患者血清中表达升高，对乳腺癌诊断的敏感度和特异性高达94.40%、
90.00%。Shuai Li等[49]研究报道miR-382-5p在乳腺癌中表达显著下调。
miR-10b在促转录因子Twist诱导下表达上升，来抑制同源异形盒蛋白D10（homeobox protein D10，HOXD10）的翻译，导致Rho GTP酶RHOC表达增加，引起乳腺癌细胞发生侵袭、转移[50]。miR-10b还可以通过诱导钙粘附蛋白E（E-cadherin ，E-cad）促进乳腺癌细胞发生转移[51]。miR-10b高表达会直接导致乳腺癌细胞发生转移，可以作为乳腺癌转移的生物标志物[52]。Zhao等[53]采用qRT-PCR技术，对122例乳腺癌患者血清（发生骨转移或未发生骨转移）和59例正常对照者血清miR-10b表达水平进行了研究，发现乳腺癌血清miR-10b对诊断骨转移患者的AUC为0.769，敏感度和特异性为64.8%和69.5%，提示血清miR-10b可作为乳腺癌骨转移的肿瘤标志物。
Schwarzenbach等[54]对102例乳腺癌患者、34例术后乳腺癌患者、32例乳腺良性疾病患者、53例健康女性的血清miR-214表达水平进行了检测，结果显示发生淋巴结转移的乳腺癌患者血清miR-214表达水平升高（P=0.039），miR-214在乳腺良性病变和正常对照中表达有显著性差异（P=0.0001），提示miR-214参与了乳腺癌的发生、发展，与乳腺癌的淋巴结转移密切相关。
3.6 早期乳腺癌差异表达miRNA
乳腺癌患者若早期予以手术治疗，5年生存率高达60%以上，所以乳腺癌早期诊断具有重要意义，但目前临床上缺乏早期、有效的乳腺癌诊断方法。通过研究发现，循环miRNA可以作为乳腺癌早期诊断的工具。
Godfrey等[55]利用Affymetrix基因芯片技术对410例健康女性的血清miRNA表达水平进行了检测，其中205例女性在日后发生了乳腺癌，205例未发生乳腺癌，共筛选出21个差异性表达miRNAs，通过qRT-PCR技术验证筛选出的miRNA，得到3个显著性高表达miRNAs：miR-18a、 miR-181a和miR-222，因此该3个miRNAs可以用于乳腺癌患者的早期诊断。Zearo等[56]通过TLDA技术对39例早期乳腺癌患者和10例健康对照者血清miRNA进行了小样本筛查，得到17个早期乳腺高表达血清miRNAs，采用qRT-PCR验证，最终发现血清miR-484在早期乳腺癌患者高表达，可以对乳腺癌患者进行早期诊断。
研究发现循环miRNA可以对乳腺癌患者进行早期诊断，能够大大提高患者早期手术的机会，延长患者的生存期。
4 乳腺癌miRNA的靶基因
miRNA主要是通过作用于靶基因mRNA在转录后水平对基因表达行负调控，每个miRNA 可能调节数百个靶基因,作用关系网络复杂，见图1[25]。
图1 乳腺癌miRNAs与靶基因相互作用关系
注：蓝色圆圈：miRNAs；深红色圆圈：仅与一个miRNA作用的靶基因；
粉红色圆圈：与多个miRNA作用的靶基因。
每个miRNA调控通路涉及多个基因，通路上任何一个基因表达异常都会引起miRNA细胞信号转导失调，导致细胞分化、增殖异常，参与肿瘤发生发展。有的靶基因可接受不同miRNA的调控表达。CCND1是细胞周期的重要调控因子，在G1早期，CCND1主要与CDK4或CDK6结合形成cyclin D1-CDK4/ CDK6复合物，促进细胞由G1期向S期转换。miR-195-5p、miR- 17-5p和miR-20a 可以通过结合CCND1，抑制乳腺癌细胞周期向S期过渡，抑制细胞增殖和肿瘤集落形成[45] [57]。PTEN属于肿瘤抑制基因家族中的一种，其异常表达与人类多种肿瘤有关，在乳腺癌中PTEN基因是多个miRNA的靶基因。miR-20b、 miR-301通过碱基互补配对原则结合靶基因PTEN mRNA 的3′ UTR，在转录后水平抑制PTEN蛋白表达，促进乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移[58] [59]。乳腺癌患者若是出现HER2过表达易发生远处转移、化疗药物曲妥单抗耐受，Ye等[60]研究发现HER2阳性乳腺癌患者，miR-221与靶基因PTEN结合，抑制乳腺癌细胞凋亡，促进曲妥单抗抵抗及远处转移。上述miR-214也是通过作用于PTEN来发挥其促进乳腺癌淋巴结转移功能的[54]。Bcl-2是一种原癌基因，具有抑制凋亡的作用，在乳腺癌中Bcl-2是miR-21的主要靶基因[26]。Zhu等[61]研究报道miR-181a通过抑制靶基因Bcl-2的作用，增强乳腺癌细胞对抗肿瘤药物阿霉素的敏感性，促进乳腺癌细胞凋亡。
由此可见，乳腺癌miRNA与靶基因的相互作用关系及其复杂，通过研究乳腺癌miRNA的靶基因可以更为深入了解miRNA的作用通路，为乳腺癌类型鉴别、乳腺癌患者的个体化治疗、疗效监测提供新的思路。
5 总结与展望
循环miRNA作为乳腺癌肿瘤标志物具有其独特优势：标本易获取、表达稳定、无创等，对乳腺癌诊断具有较高效率。循环miRNA与复杂的靶基因网络作用，通过多种方法参与乳腺癌发生、发展或表达上调，通过与靶基因结合，起到癌基因的作用；或表达下调，发挥肿瘤抑制基因功能；或双向表达，双向调控；或与乳腺癌患者的病理指标（淋巴结、ER、PR、HER2）状态有关；或促进/抑制侵袭、转移；或与手术、放化疗治疗效果有关。总之，循环miRNA既可以作为乳腺癌的诊断标志物，又能用于乳腺癌临床分期的鉴别，还可监测乳腺癌个体化治疗、预后效果等。
近年来，国内外有关乳腺癌循环miRNA的研究越来越多，但是目前的研究还只停留在实验阶段，还未能真正运用到临床，这有待我们进一步研究发现，使乳腺癌血清miRNAs差异表达谱更加完善，为乳腺癌循环miRNA的临床应用提供新的依据。
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