Bel06亚型的血清学及分子遗传学分析

林 智 杰

本钢总医院检验科，辽宁本溪117000

【摘要】  目的 研究ABO变异体Bel06亚型的血清学特征及分子遗传背景。方法 标准血型血清学方法鉴定ABO血型，对先证者ABO基因第6、7外显子PCR产物直接测序和基因克隆方法进行基因型鉴定。结果 血清学鉴定为Bel亚型。直接测序分析存在261G缺失，297A/G、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、905A/G和930G/A杂合突变。基因克隆测序分析存在Bel06和O01两个等位基因。Bel06等位基因与B101序列比对第7外显子存在905A>G突变，导致多肽链D302G替换。结论 α-1,3半乳糖基转移酶基因nt905A>G突变导致B抗原表达减弱。

【关键词】ABO基因；Bel 亚型；α-1,3半乳糖基转移酶

The serological characteristic and molecular genetic analysis of an individual with Bel06 subtypes

LIN Zhi-Jie, Clinical Laboratory, General Hospital of Benxi Iron ，Benxi 117000，Liaoning Province，China)

【Abstract】 Objective  To investigate the serological characteristic and genetic background of Bel06 subgroup of ABO variant. Methods  Standard serological assays were performed to identify ABO blood group on the samples of the proband. The exons 6~7 of ABO genes were amplified by specific PCR, the PCR products were sequenced directly and gene clones. Result The proband was identified as Bel phenotype by serological technology. DNA sequencing showed 261delG，297A/G、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、905A/G和930G/A heterozygotes from exon6 to exon7. By gene cloned and sequence analysis, two alleles Bel06 and O01 were found. The sequence of Bel06 allele had a nucleotides change (A to G) at position 905 compared with that of B101 allele, resulting in an amino acid substitution (D302G). Conclusion A>G at nt905 of α-1,3galactosyltransferase gene could result in the reduction of B antigen.

【Key words】 ABO gene；Bel subgroup ；α-1,3galactosyltransferase

     ABO血型在输血医学中具有重要意义。ABO血型除了常见的A型、B型、AB型和O型表型外，还存在ABO亚型。这些亚型在我们常规检测中常常表现为正反定型不一致。给我们血型鉴定及临床输血带来困难。我们在日常ABO血型鉴定工作中发现1例血清学鉴定为B亚型的样本，采用基因测序及克隆技术进一步分析，鉴定其基因型为Bel06。现报告如下。

1材料与方法

1.1对象 2017年5月我实验室发现1例ABO正反定型不符样本。先证者，男性，56岁，直肠癌，手术治疗，术前备血。无输血史，无其他疾病，未进行药物治疗。样本采集遵循知情同意原则

1.2.血清学试验：标准血型血清学检测ABO正反定型、吸收放散试验和ABH血型物质遵照参考文献^[1]进行操作。所用试剂抗-A、-B血型定型试剂，抗-A1、-A+B、-H血型定型试剂和人ABO血型反定型红细胞(上海市血液中心生物医药有限责任公司和北京金豪医药有限责任公司）。

1.3.ABO基因直接测序：采用TIANamp Blood DNA Kit试剂盒提取，严格按照说明书操作，DNA浓度调为65.4 ng/ul，DNA纯度A260/A280比率在1.89。ABO基因位点扩增方法，扩增引物及测序引物见参考文献^[2]。BigDye terminator 3.1 Sequencing kit试剂盒（美国ABI公司）进行测序反应，进行正反两个方向测序。用ABI PRISM 3730xl测序仪进行电泳。

1.4.ABO基因克隆测序：采用promega公司pGEM-T克隆试剂盒将ABO基因第6～7外显子PCR扩增产物严格按照试剂说明进行克隆。使用软件FinchTV阅读测序图谱，与Genbank：NG _006669序列进行比对，确定样本基因型。

2.结 果

2.1 血清学检测结果先证者正定型中抗-A、抗-A1、抗-B和抗A+B不凝集，抗-H凝集4+，反定型Ac凝集4+，Bc弱凝集，Oc和自身细胞不凝集。ABO正反定型结果见表1。吸收放散实验检测含有B抗原。唾液血型物质检测只含有H物质。先证者红细胞与抗-B、抗-A+B不凝集，吸收放散检测含有B抗原，但血型物质不含有B物质，只有H物质，血清中含有抗-B抗体。与Bel亚型的血清学特征相符。

表1  先证者血清学检测结果

2.2 ABO基因的DNA直接与克隆序列分析：对先证者的ABO基因第6-7外显子基因直接测序分析，在第6外显子存在261G缺失，检测到297A/G、526C/G、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、905A/G和930G/A共8个杂合位点。对该样本进行基因克隆，挑取多个细胞克隆后序列测定发现2种单倍型，其中1种为O01型，另1种单倍型与B101基因比对的差异仅在第7外显子nt905位A>G突变，见图。通过基因克隆和直接测序结果相互验证，排除碱基假突变。国际血型抗原突变库^[3]中检索Bel06和Bx02与B101比较均为nt905A>G。

图1. ABO基因905A>G突变直接测序与克隆测序结果与B101等位基因序列比对

3.讨 论

1990年，Yamamoto等^[4]通过基因克隆和测序，首次阐明了ABO血型系统中A₁、B、O 3个主要等位基因的分子生物学基础。此后，随着分子生物学检测技术的发展，血型分子生物学研究进入了新的发展阶段。本研究通过对1名B亚型个体的ABO基因研究，鉴定为Bel06等位基因。

目前发现的ABO等位基因已达到350多个，发现11种Bel等位基因。分析NCBI血型抗原基因突变数据库^[3]，905位碱基A>G突变有三种等位基因，分别是Ax18、Bel06和Bx02。Ax18等位基因存在467C>T和905A>G，467C>T突变为单核苷酸多态性，而非A血型抗原性减弱所必需^[5]，因此，Ax18亚型A抗原减弱，可能主要是905位碱基A>G突变造成。Bx02等位基因^[6]和 Bel06^[7]等位基因都是发现905位A>G突变。本研究发现nt905位A>G突变样本，血清学结果与Bel亚型结果相符。这从另一侧面再次说明了不同的ABO亚型可能有共同的分子生物学基础。

905A>G突变的Bel06等位基因导致B糖基转移酶活性的明显下降，产生仅能在的吸收放散实验中才能检出的Bel表型^[7]。905A>G点突变，导致B糖基转移酶中302位氨基酸由天门冬氨基酸到甘氨酸的改变。D302G氨基酸替换改变了酶的高度保守区域，并减弱了糖基转移酶的活性，导致了B抗原的表达减弱^[8]。本例患者容易误判为O型，正定型血清学为O型，含有弱B抗原，患者输血建议输O型洗涤和AB型血浆。Bel亚型的患者或献血者在ABO血型鉴定时，除采用常规的血型血清学方法外，应增加基因检测技术提高血型鉴定的正确率，避免输注血型不相合的血液引起严重输血反应，有效保障临床输血安全，提高输血的有效性。

参考文献

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