噬菌体对水产病原菌的防控的进展

孙敬^1,2，柯浩²，冯国清²

1、上海海洋大学，2、广东省农业科学院动物卫生研究所

摘 要：细菌耐药性日益加剧，免疫抑制病的发病率逐步升高，细菌疾病引发的水产动物病害成为限制水产养殖业快速稳定发展的重要因素，寻找一种有效的抗菌剂成为亟待解决的问题。噬菌体疗法被认为是最有可能解决当前问题的方法之一，在细菌防控中有诸多方面优势，并取得了可喜成果。然而，噬菌体的广泛使用依旧存在着很多问题，需要大量的研究与技术上的突破，裂解酶成为了可能的突破口，本文就噬菌体在防控以水产动物细菌性疾病方面为重点取得的研究进展进行综述，为噬菌体的研究及应用提供理论基础及实践参考。

关键词：噬菌体，水产养殖，病原菌，防控

中图分类号：S917.1

Progress in the prevention and control of phage against aquatic pathogens

Abstract：The bacterial resistance is increasing, the incidence of immunosuppressive diseases is gradually increasing, and the aquatic animal diseases caused by bacterial diseases have become an important factor restricting the rapid and stable development of the aquaculture industry. Finding an effective antibacterial agent has become an urgent problem to be solved. Phage therapy is considered to be one of the most likely ways to solve the current problems. It has many advantages in bacterial prevention and control, and has achieved gratifying results. However, there are still many problems in the widespread use of phage, which requires a lot of research and technical breakthroughs. Lysis enzymes have become a possible breakthrough. In this paper, the research progress of phage in the prevention and control of bacterial diseases in aquatic animals is carried out. Review, provide theoretical basis and practical reference for the research and application of phage.

Key words:Phage,Aquaculture,Pathogen，Prevention and control

1  引言

联合国粮农组织（FAO）最新发布的《世界渔业和水产养殖状况》显示，全球鱼类产量在2016年达到约1.71亿吨的峰值，其中水产养殖占总数的47%，人均鱼类食品消费量由1961年的9.0公斤增至2015年的20.2公斤，年均增长率约为1.5%。然而，逐年增长的养殖量和有限的空间导致的高密度集约化养殖模式引发的细菌性疾病，成为妨碍水产养殖业持续发展的重要因素，细菌耐药性和抗生素药物残留问题的出现，让人们意识到需要寻求新的解决方法。

噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌、真菌、藻类 、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体，被认为是引起基因水平移动的主要载体，是驱动生命进化的主要动力^[1]。自Twort于1915年和d'Hérelle在1917年发现噬菌体以来，噬菌体已经有近百年的历史了^[2]，在噬菌体发现之初，人们就意识到噬菌体在治疗细菌感染上的巨大作用，并用于治疗葡萄球菌皮肤感染^[3]。近些年来，噬菌体疗法因为其特异性强、见效快、无毒害、无污染等特点，备受关注，本文总结了噬菌体以水产病原体为重点的抗菌研究结果，并分析了其作为新兴抑菌手段的优势与不足，希望为后续的研究和应用提供方向。

2  噬菌体的生物学特性

2.1 噬菌体的形态特征

噬菌体的组成虽然简单，但它们在地球生物圈中具有最多样化的生命形式。噬菌体基因的多样性远超过它们宿主细菌的数量，高达 10^31[4]。噬菌体的主要形态：蝌蚪形、微球形、细杆形，以蝌蚪形多见。噬菌体颗粒在结构上一般可分为：有尾和无尾结构二十面体及线状体三种类型。噬菌体是一种普遍存在的生物体，而且经常都伴随着细菌。通常在一些充满细菌群落的地方，如：泥土、动物的内脏里，都可以找到噬菌体的踪影。世上蕴含最丰富噬菌体的地方是海水。根据噬菌体核酸类型为DNA和RNA以及单双链之分，可分为单链RNA噬菌体，双链RNA噬菌体，ØX174噬菌体，丝状噬菌体，T7噬菌体，T4噬菌体，Ø29噬菌体，PRD1噬菌体，λ噬菌体，Mu噬菌体， P22噬菌体等^[5]。

2.2  噬菌体的侵染机制

噬菌体侵染宿主菌的机制主要有两种。一种为裂解循环，侵染过程分为五步^[6] :（1）吸附，噬菌体表

面的一个或多个蛋白质与宿主表面的受体特异性识别、结合、吸附；（2）穿入，噬菌体将核酸注入到宿主内，蛋白质衣壳留在宿主外；（3）增殖，当核酸注入宿主后，利用宿主的氨基酸、核苷酸等物质及能量合成子代噬菌体的各个组分；（4）装配，各组分进行自主装配或在酶的催化下装配合成子代噬菌体；（5）子代噬菌体释放。另一种侵染机制为溶源循环，与裂解循环不同，按上述机制侵染宿主菌的噬菌体在将遗传物质注入宿主细胞后，不会马上增殖，而是将其遗传物质整合到宿主的染色体上，随着宿主 DNA 的复制而复制，当条件发生改变，比如紫外照射或丝裂霉素C诱导，噬菌体开始增殖，释放出子代噬菌体^[7]。人们多采用空斑计数法(plaque  assays，Pas)和最大可能计数法(most-probable-number assays，MPNs)对它们进行研究。空斑法即双层平板法，最常配合梯度稀释法检测噬菌体数量^[8]。

2.3 噬菌体宿主细菌的攻防机制

   噬菌体与细菌在亿万年的共进化过程中彼此都进化出了多种多样的反制策略，为了从噬菌体的感染中存活下来，宿主菌必须在噬菌体颗粒成熟释放之前采取策略遏制噬菌体的传播和增殖，因此针对吸附、侵入、增殖这几个步骤细菌发展出了切割侵入核酸、流产性感染、阻断吸附和阻断DNA侵入多种防御机制。噬菌体进化出的各种对抗细菌防御的方式，包括对抗吸附阻碍、对抗R-M系统、对抗cRISPR-CaS系统、对抗流产性感染系统^[9]。

3  噬菌体防控和治疗细菌新疾病的研究进展

    噬菌体治疗是指利用噬菌体对宿主菌的专一裂解性来分离病原菌，是用于杀死感染组织中病原菌的一种治疗方法，d'Herelle在1929年首次提提出出将噬菌体用作治疗剂^[10]，后来噬菌体的研究由于广谱抗生素的引入而放弃了，因为抗生素既便宜又容易替代。然而，噬菌体制剂被广泛用于东欧许多细菌感染的诊断、预防和治疗^[11]。裂解噬菌体具有特定的控制细菌病原体的能力，并且没有抗生素的负面环境影响，因此被公认为生物治疗药物。

噬菌体在水产病原体防控方面多为从宿主细菌中分离噬菌体，再通过泼洒、口服等给药方式研究该噬菌体对其相关动物的抑菌作用，包括哈维弧菌(Vibrio harveyi)、绿脓杆菌（P.aeruginosa）、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、嗜水气单胞菌（Hydrophilus）等。

3.1 哈维弧菌及其噬菌体治疗

哈维弧菌(Vibrio harveyi)广泛分布于水生环境中，可在水中独立生存，也可作为生物被膜的一部分，或者存在于水产动物的体表和肠道中，能够感染多种动物^[12]。

Surekha^[13]分析了单一噬菌体和噬菌体“鸡尾酒”对斑节对虾的防控效果。单一细菌攻毒试验中, 与各自对照组相比, 噬菌体Viha15、Viha19和Viha32治疗组仔虾存活率分别提高了42%、30%和43%; 噬菌体Viha 6和Viha 21处理组仔虾存活率略低于仅攻毒组。混合菌攻毒试验中,与仅攻毒组的仔虾存活率17%相比。噬菌体Vi ha19 (仔虾存活率为64%) 和噬菌体“鸡尾酒” (仔虾存活率为60%) 均显著提高攻毒仔虾存活率 (P<0.05）。相比于其他4株噬菌体和噬菌体“鸡尾酒”,噬菌体Viha19能更好的保护斑节对虾,可被认为是应用噬菌体防控水产养殖动物弧菌病理想的选择。

3.2 绿脓杆菌治疗

绿脓杆菌（P.aeruginosa）或称铜绿色假单胞菌，是一种致病力较低但抗药性强的杆菌。广泛存在于自然界，是伤口感染较常见的一种细菌。能引起化脓性病变。感染后因脓汁和渗出液等病料呈绿色，是临床上较常见的条件致病菌之一，也可引起龟和淡水鱼感染。

Khairnar等^[14]使用煤床分离和浓缩特异性噬菌体并通过核苷酸测序和电子显微镜表征分离的和富集的噬菌体，用于治疗鲶鱼类的溃疡性病变。在分离到的20株铜绿假单胞菌中，有1株表现出多重耐药(MDR)，而经亚胺培南-EDTA纸片法测定，其β-内酰胺酶（MBL）产生率较高，通过噬菌体疗法在治疗8-10天内可有效治愈了感染鱼的溃疡病变，未治疗的病灶感染比对照组减少了7倍。

3.3  副溶血弧菌及其噬菌体治疗

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是一种人畜共患病原菌，目前已成为全世界范围内重点关注的食源性致病菌，其广泛分布于海水及鱼、虾、蟹、贝等水产品中，2009 年以来暴发的南美白对虾早期肝胰腺坏死症（hepatopancreas necrosis syndrome, HPNS）的病原菌就是副溶血弧菌

王娜^[15]通过对与AHPND 相关的副溶血弧菌进行溶源噬菌体的筛选，观察及其它相关的工作，以明确溶源噬菌体与副溶血弧菌毒力情况之间的关系。Kumarappa等^[16]用三种噬菌体（VP1，VP7和VP9）和致病性副溶血性弧菌（BG 24）以噬菌体（个体和鸡尾酒）分散在水中并与饲喂的饮食混合进行控制黑虎对虾（P. monodon）中的副溶血性弧菌感染。在噬菌体喂养期间进行饮食实验研究，虾免疫参数，肠道噬菌体计数和监测细菌计数。噬菌体鸡尾酒喂养的虾的结果良好，细胞数量大幅减少。同样，在鸡尾酒噬菌体处理的虾中观察到高的总酚氧化酶和呼吸爆发活性（超氧阴离子）。在所有噬菌体处理组中溶菌酶活性逐渐增加，而对照组则显着降低。结果表明噬菌体会感染虾肠道中的副溶血性弧菌，裂解后的弧菌碎片在虾中产生可免疫反应，可以作为免疫刺激剂对抗任何非特异性的感染。噬菌体鸡尾酒的应用将改善虾免疫系统，用作虾的特定感染的治疗和预防措施。

3.4  鳗弧菌及其噬菌体治疗

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是一种海洋细菌，可以引起许多有经济鱼类罹患弧菌病。Gastón等^[17]提出六种噬菌体的分离和表征，能够感染鳗弧菌PF4的致病菌株。这些噬菌体都具有相似的双链DNA（dsDNA）基因组，但根据它们的限制模式，可以分化为三种类型。噬菌体表现出相似的宿主范围，感染鳗弧菌和奥氏弧菌（V.ordalii），但不感染副溶血性弧菌菌株。用菌株PF4对抗实验诱导的弧菌病。当噬菌体以1和20MOI使用时，噬菌体的存在将鱼的存活率提高至100％，而在不存在噬菌体的情况下，存活率小于10％。

3.5 嗜水气单胞杆菌及其噬菌体治疗

嗜水气单胞菌（A.hydrophilus）是水产养殖中最为常见的条件致病菌，在大部分水产养殖水体中均能检测到该细菌。该细菌为多致病因素原菌，具有较强的毒性，能够释放毒素( 细胞毒性和细胞紧张性刺激物) 、内毒素( 脂多糖) 、蛋白酶、溶血素、肠毒素和各种酶。

吕孙建等^[18]从中华鳖养殖塘中分离得到气单胞菌噬菌体1 株，并对其抑菌效果进行研究，结果发现该噬菌体对中华鳖及对虾发病养殖塘中分离得到的嗜水气单胞菌及副溶血弧菌均有明显的抑制效果。在体外试验还发现该噬菌体能够有效治疗中华鳖的腐皮病。

3.6 其他水产研究成果

众多学者对噬菌体进行了多种动物，多种角度的研究与分析。高珊珊^[19]，徐华东^[20]等对噬菌体的分离鉴定及其相关生物学特性的分析，另外，Elina等^[21]首次报告了噬菌体-宿主相互作用对商业重要鱼类病原体的影响，其中噬菌体抗性与细菌毒力下降直接相关。结果表明，噬菌体在鱼类寄主之外会引起表型变化，细菌病原体与寄生噬菌体之间的拮抗作用在自然条件下有利于降低细菌毒力。Nanna等^[22]用噬菌体kvp 40对幼虫死亡率和细菌丰度进行量化，结果表明噬菌体kvp 40对幼鱼孵化和初期生长的显著正向影响，噬菌体在降低鳕鱼和大菱鲆孵化场病原体载量方面的潜力，也可能是提高卵质量的一种策略，Luo等^[23]从罗非鱼池中分离出噬菌体HN48可特异性裂解无乳链球菌（S.agalactiae），探索了给药途径、治疗时间和剂量对治疗效果的影响，结论得出HN48在罗非鱼无菌感染的治疗中有很大的应用前景，但噬菌体治疗在水产养殖中的效果取决于环境条件，如温度和pH，疾病的早期诊断，静脉给药的实用性，鱼体重量与所需噬菌体剂量的关系等。陈海阳^[24]则是首次采用大肠杆菌噬菌体处理养殖海水进行了相关研究。

4 噬菌体治疗的优势和存在的问题

噬菌体治疗成为替代抗生素的曙光，然而，优势与弊端并存，部分商品已经开发成功，但是大范围的使用仍需要大量的研究。

4.1  噬菌体用于水产养殖的优势

抗生素和化学药物的长期滥用带来了诸多弊端:（1）病原菌大量产生耐药性，抗生素的效果显著下降，甚至无效;(2）严重污染水体，引发水环境微生态失衡;（3）在动物体内产生药物残留，通过生物累计作用危害人体健康。因此，当前研究的热点和难点是寻求到一种既能有效控制水产养殖动物疾病，又不会带来毒副作用的新技术、新产品，来部分或完全替代现有抗生素和化学药物。

利用噬菌体制剂在治疗细菌性水产养殖疾病方面有诸多优势，可有效克服上述问题:（1）对细菌耐药性适应性强，虽然细菌也会对噬菌体产生抗性，然而噬菌体有更快的变异和复制速度，能够适应宿主生物的变异;（2）专一性强，噬菌体只针对其特定的细菌病原菌作为宿主，不会破坏正常菌群;（3）无残留、无毒害，噬菌体具有宿主依赖性，随宿主的清除而消亡，不会残留在动物体内 ^[25]，而且噬菌体的降解终产物为氨基酸和核苷酸，对人和动物无影响。

4.2  噬菌体用于水产养殖面临的问题

虽然噬菌体疗法的优势不少，但是在噬菌体治疗的过程中也会存在一些局限性即：噬菌体疗法的宿主谱狭窄，在治疗之前一定要先确定出致病细菌的类型；噬菌体在体内停留时间较短，可以被快速去除，不足以产生治疗效果的作用；噬菌体自身携带某些毒力基因，在宿主体内产生生物学变异，容易引发宿主疾病，改变宿主菌特异性，影响治疗效果；噬菌体与宿主菌均处于同步生长周期时有利于噬菌体附着，因此不易掌握噬菌体治疗的最佳时间和使用剂量；对不同细菌种类的噬菌体缺乏更深入的了解；噬菌体疗法的效率目前没有科学性的理论支撑。

面对上述诸多限制性因素，研究者试图提取噬菌体对病原菌直接产生灭菌活性的有效成分，这让噬菌体裂解酶成为噬菌体研究中的新焦点。

5.  应用噬菌体裂解酶防控细菌病原

噬菌体侵染宿主细菌后，利用细菌细胞内的营养物质大量合成子代噬菌体的DNA和蛋白质，最后组装成完整的噬菌体颗粒，病毒复制晚期被合成，细胞会大量合成溶解细菌细胞壁的一种水解酶，即噬菌体裂解酶（又称内溶素，endolysin或lysin），裂解酶在噬菌体的溶菌过程中起决定作用^[26]。很多噬菌体有酰胺酶、内肽酶和裂解酶3种细胞壁水解酶，其中酰胺酶是大家研究的比较多的一种裂解酶。第一个噬菌体裂解酶是在20世纪50年代发现的，但是该裂解酶对死细胞有作用，对活细胞无效果^[27]。此后，陆续发现了其他细菌的噬菌体裂解酶，并利用基因工程技术使其在大肠杆菌中表达并制备。目前，已有关于分枝杆菌^[28]，A型产气夹膜梭菌^[29]，金黄色葡萄球菌^[30]，李斯特菌^[31]，链球菌^[32]，沙门氏菌，副溶血弧菌^[33]等细菌裂解酶的研究报道。

5.1  裂解酶的提取

裂解酶的提取纯化方法有两种，一种是天然产物的物理方法提取，另外一种是基因重组表达。天然产物的物理提取方法适用于任何噬菌体，在噬菌体增殖液中结合超速离心、硫酸铵盐析、柱层析等传统的纯化方法提取裂解酶。但是天然产物物理方法提取后的粗酶液中成分比较复杂，酶活的稳定性比较差，得率相对较低。因此目前研究方法多集中在基因表达上。基因重组蛋白适用于有基因序列的内溶素并且其功能明确为内溶素。技术涉及到表达载体的选择、蛋白的正确表达及重组蛋白的折叠构型都是决定重组蛋白是否能成功表达的重要因素。基因工程方法的难点在于保证重组蛋白的成功表达同时还要保证酶的活性。除此之外基因工程的安全性也是限制其应用的主要方面。

5.2  裂解酶特性

（1）具有极高的特异性。相应细菌只能被相应噬菌体产生的酶特定杀死，噬菌体本身几乎不会影响到正常的菌群。

（2）作用效率极高。体外实验中，噬菌体裂解酶在与细菌接触后数秒内就可以使细菌细胞破裂。

（3）具有协同作用。噬菌体裂解酶可以与抗生素一同使用来提高作用效果。

（4）难以产生抗药性。细菌对噬菌体产生的耐受性和传统抗生素相比较很慢。

（5）具有高效的裂菌能力。

人们曾经认为噬菌体裂解酶在灭菌时将导致肽聚糖和内毒素磷壁酸等存在于细胞膜、细胞壁上的多种促炎性物质释放，增加机体产生感染性休克和多器官衰竭的风险，但是至今并没有相关报道流出。综上所述，噬菌体裂解酶在应用时并没有很高的危险性。

5.3  相比噬菌体的优势

由于裂解酶的特异性与细菌现存的细胞壁糖基有关，因此细菌难以对其产生抗性。裂解酶在作用于细菌时没有类似噬菌体的吸附阶段，而是直接在细菌的细胞壁上进行溶菌。裂解酶对细菌可以在极短的时间内产生杀伤作用，细菌几乎不会产生抗性。人们能够应用原核和真核表达裂解酶实现大量生产。因此，噬菌体及其裂解酶在应用于对细菌感染的治疗方面有着极大的优势。 

6  展望

在溶菌噬菌体发现之初，人们建议将噬菌体作为治疗剂，廉价高效抗生素的产生却曾经使噬菌体的研究停滞不前。然而，传统抗生素的局限性让噬菌体重新回到人们视野，许多实验都表明了使用噬菌体治疗细菌感染的可能性。噬菌体疗法除了用于水产养殖外，在畜禽动物细菌疾病的防治方面也颇有成效^[34]，在商业物种如海参、刺参^[35]等方面也有着良好的应用前景，在食品加工行业和污水治疗等方面也能被有效利用。

噬菌体治疗是治疗细菌疾病的有效方法，但商品化的产品并不多，因为生物制剂对环境的依赖性较高，可变因素较多，需要对温度，给药方法等进行进一步的研究，才有可能将噬菌体用于广泛有效的应用，于是众多学者对噬菌体进行了全方位，多角度的研究，希望可以早日将噬菌体运用到实际生产中。

目前而言，较为理想的方式是分离出一些足够广谱的噬菌体，可以对抗多种细菌，且不易产生抗性，Parichat等^[36]一直为之努力，但相对来说难度较大。随着基因工程的发展。人们尝试通过改变基因的方法，人为制造能裂解多种细菌的噬菌体，扩大其宿主谱，期待在这方面取得突破。针对细菌对噬菌体产生抗性的问题，噬菌体裂解酶制剂的成功研发或许可有效解决，多种噬菌体组成的噬菌体“鸡尾酒”也可以减缓抗性细菌富集的速度。为了提高疾病防治的效率，噬菌体和疫苗结合使用被证明是有效的措施。相信通过众多学者的不断努力，最终一定可以将噬菌体及其相关商品简便、广泛的使用与各个行业。

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