干细胞疗法在宫腔粘连子宫内膜再生修复中的研究进展

[摘要]近年来，随着诊疗技术的应用以及人工流产率的不断升高，宫腔粘连的发病率呈上升趋势，宫腔粘连已成为女性继发性不孕的第二大病因。现有的治疗手段并不能从根本上解决宫腔粘连患者子宫内膜缺失的问题，治疗后复发率高，疗效并不理想。干细胞疗法作为再生医学的一种新型治疗方法为解决这一临床难题带来了希望，现就干细胞疗法在宫腔粘连子宫内膜再生修复中的研究现状展开综述。
[关键词]宫腔粘连；干细胞；子宫内膜；
宫腔粘连（intrauterine adhesions，IUA），又称Asherman 综合征，于1894年由Fritsch首次报道，1948年由Asherman首次对其进行详细描述，定义为由于各种因素导致子宫腔或颈管内膜基底层损伤，继而引起宫腔肌壁和（或）颈管的相互粘连,以致宫颈管、子宫腔部分或全部闭塞的一组疾病[1]。临床表现主要为周期性下腹痛、闭经或月经量减少、继发性不孕、反复流产及胎盘异常等。近年来，随着诊疗技术的应用和人工流产率的不断升高，IUA的发病率呈上升趋势，IUA已成为严重影响育龄期女性生活质量及生殖预后的顽症之一。现应用于治疗IUA的方法主要有宫腔镜下粘连松解术、激素治疗和物理屏障等，但这些治疗措施大多只能轻微改变子宫内膜的厚度以及随后的妊娠率，并没有从根本上解决子宫内膜缺失的问题，治疗后复发率高，疗效并不理想。为解决这一临床难题，科学家们提出了一种新型治疗方法—干细胞疗法，即将自体或异体来源的人干细胞经体外操作后输入或植入人体，以期通过干细胞替代子宫内膜中的受损细胞，促进子宫内膜的再生修复。本文将对现有研究进行简要回顾，讨论干细胞疗法在IUA子宫内膜再生修复中的研究进展。
1 IUA病因及病理
1.1 子宫内膜
人类子宫内膜是一种高度再生的组织，在女性生育年龄期间经历了400多次生长、分化和脱落周期。从细胞类型而言，子宫内膜由两种细胞构成：上皮细胞和间质细胞；从功能角度而言，子宫内膜由两层构成：外部功能层和内部基底层。在月经周期增殖期间雌激素水平增加的影响下，子宫内膜每个周期生长4-10毫米。功能层由于激素水平的变化每月脱落产生月经，并在月经后迅速重建[2]。子宫内膜再生也可以发生于分娩或子宫内膜切除术后，并且可以发生于接受雌激素替代治疗的绝经后妇女。这种组织再生水平类似于造血组织、肠上皮组织和表皮组织。在这些不断再生的组织中，成体干细胞维持细胞的生成。最初认为负责子宫内膜循环再生的子宫内膜干细胞仅位于子宫内膜基底层，但越来越多的证据表明子宫内膜的功能层和基底层可能都存在子宫内膜干细胞[3]。
1.2 IUA病因
IUA的形成继发于子宫内膜基底层损伤，任何引起子宫内膜损伤的因素都可能导致子宫内膜粘连。Conforti[4]于2013年发表的论文中总结了IUA的常见危险因素：医源性创伤如流产后刮宫、诊断性刮宫、宫腔镜手术等引起的子宫内膜损伤，其中流产后刮宫与IUA的关联性最高;感染如结核分枝杆菌感染、血吸虫感染;遗传因素。其中，感染在IUA发病机制中的作用存在争议，David认为感染的存在对于产生粘连而言是必不可少的，而Jensen和Polishuk等人认为感染的存在和IUA之间没有任何关系[5]。此外，Salazar[6]等人认为在低雌激素水平及子宫缺血缺氧等情况下，可能存在更高的IUA的形成倾向。 
1.3 IUA病理
Chen[7]等人在电子显微镜下观察了IUA患者的子宫内膜，发现IUA的病理学表现为：宫腔内形成纤维性粘连，纤维组织附着部位残留少量或完全缺乏正常的子宫内膜组织，正常子宫内膜组织被无活性的单层柱状上皮及间质纤维组织所替代，间质中的毛细血管出现闭合或狭窄，大量胶原蛋白聚集并包围血管，粘连部位处于缺血缺氧的微环境。
2 干细胞
干细胞可以被定义为负责器官和组织再生发育的生物组织单位，是一类具有自我复制、自我更新及旁分泌能力的多分化潜能细胞，根据其所处的发育阶段可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs）和成体干细胞（adult stem cells，ASCs）。而ASCs中的间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）因其具有以下特性：易于从各种组织中分离、增殖和分化能力优越、受损组织趋向性、弱免疫原性及免疫调节作用，已成为细胞治疗和再生医学的最佳选择。
2.1 ESCs
ESCs起源于囊胚，属于多能干细胞，可以分化为体内任何细胞类型。自1998年Thomson首次分离出人ESCs以来，许多研究都集中在将它们体外分化为临床相关的细胞类型，以用于再生医学。
2.1.1 ESCs应用于子宫内膜再生修复的研究现状
2015年Yu[8]、Niu[9]等人相继研究发现在特定条件下可以将人ESCs体外诱导分化为子宫内膜样细胞，这一发现对人ESCs应用于子宫内膜的再生修复具有重要意义。同年song[10]等人通过人ESCs与子宫内膜间质细胞共培养成功将人ESCs体外诱导分化为子宫内膜样细胞，并将承载了人ESCs诱导分化的子宫内膜样细胞的胶原支架移植入子宫角全层损伤大鼠模型，结果证明该胶原支架可以显著恢复子宫角全层损伤大鼠模型中子宫角的结构和功能。
2.1.2 体外诱导ESCs向子宫内膜细胞方向定向分化
各研究体外诱导人ESCs分化的方式具有差异，Yu[8]等人发现包含了100ng/ml重组人Wnt5a蛋白、5％血清、1％非必需氨基酸（NEAA）、10ng/ml血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）、10ng/ml 表皮生长因子（EGF）、10ng/ml转化生长因子-α（TGF-α ）及10-8mol/L 17β-雌二醇（17β-E₂）的DMEM细胞培养基可以诱导人ESCs分化为子宫内膜样细胞；Niu[9]等人研究发现通过饲养细胞诱导、与子宫内膜间质细胞共培养及类胚体诱导等三种方法均能够诱导人ESCs分化为子宫内膜样细胞，其中共培养诱导分化的效率最高。
2.1.3 临床应用ESCs 
（1）优势： ESCs具有无限增殖（自我更新）的能力，能够分化为三个胚层（外胚层、中胚层及内胚层）的所有细胞谱系；
（2）局限性：①应用ESCs存在宗教伦理争议；②应用ESCs存在免疫排斥的问题；③ESCs的体外培养较为困难，技术错误可能导致ESCs的自发分化；④ESCs在长时间的体外培养过程中可能会积累遗传变化，其中一些变化类似于在肿瘤中发现的变化，移植ESCs存在致瘤性风险 [11]。
2.2 脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）
人脐带是连接于胎儿及母体之间的组织，主要由脐血管、羊膜被覆上皮以及位于两者之间的华通氏胶（Wharton's jelly）构成，人UCMSCs可来源于脐带血、脐带华通氏胶或脐带羊膜，具有MSCs的共性，可不断自我更新及多向分化[12]。
2.2.1 UCMSCs应用于子宫内膜再生修复的研究现状
2018年Zhang[13]等人将人UCMSCs通过尾静脉注射入子宫内膜损伤大鼠模型内，结果显示UCMSCs移植有助于修复受损的大鼠子宫内膜从而恢复或提高大鼠的生育能力。2018年Cao[14]等人对26例复发性IUA患者进行了宫腔内移植UCMSCs-胶原支架的一期临床实验，实验结果表明对复发性IUA患者在粘连松解术后宫腔内移植人UCMSCs-胶原支架，术后三个月患者IUA评分较治疗前降低、平均最大子宫内膜厚度增加，组织学结果显示治疗后患者子宫内膜增殖分化及血管新生均有改善，并且随访期间并未发现与治疗相关的严重不良事件。
2.2.2 临床应用UCMSCs 
（1）优势：①UCMSCs增殖能力优越，衰老缓慢，具有广泛的抗炎作用；②UCMSCs可通过非侵入方式获得；③UCMSCs相较于骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞而言，具有更强的抑制肿瘤生长的作用[15]；
（2）局限性：①UCMSCs来源受限；②UCMSCs对免疫系统的药理毒理作用及潜在致瘤性有待更多更进一步的研究。
2.3 骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）
骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells ，BMSCs）也称为骨髓间充质基质细胞或骨髓间充质干细胞，是一种存在于骨髓中的异质细胞群，广泛应用于再生医学中的组织修复。
2.3.1 BMSCs应用于子宫内膜再生修复的研究现状
近年来已有较多研究证实BMSCs移植可以有效修复受损的子宫内膜。2016年Wang[16]等人研究发现通过尾静脉注射BMSCs或宫内注射BMSCs这两种方式均能有效修复IUA受损的子宫内膜，并且宫内注射BMSCs的疗效更佳。2017年Yang[17]等人将维生素C- Pluronic F-127-BMSCs复合物注射到机械损伤法构建的IUA大鼠模型的子宫角内，治疗后8周组织学结果表明该复合物可以显著促进IUA大鼠受损子宫内膜的恢复。
2.3.2 体外诱导BMSCs向子宫内膜细胞方向定向分化
2012年Zhang [18]等人研究发现将BMSCs和子宫内膜间质细胞在诱导分化培养基（包含了2%胎牛血清、10-7mol/L 17β-E₂、10ng/ml TGF -β、10ng/ml EGF及10ng/ml PDGF-BB的DMEM/F12培养基）中共培养，可以将BMSCs体外诱导分化为子宫内膜上皮细胞，适宜浓度的17β-E₂可以促进这种分化。
2.3.3 临床应用BMSCs
（1）优势：①BMSCs可实现自体移植，免去伦理争议及免疫排斥的问题；②BMSCs能在体外培养中大量扩增，易于达到移植密度③BMSCs具有免疫调节作用，可以诱导血管生成、促进组织修复 [19]；
(2)局限性：①BMSCs的数量及增殖分化能力随着人年龄的增长而下降；②提取BMSCs的方式是一种痛苦的侵入性操作。
2.4 经血源性干细胞（menstrual blood-derived stem cells，MenSCs）
人类子宫内膜中存在三种类型的干细胞：上皮祖细胞、内皮祖细胞及间充质细胞，子宫内膜干细胞可以从月经血中非侵入性获得，称为MenSCs。
2.4.1 MenSCs应用于子宫内膜再生修复的研究现状
2017年Jiang[20]等人研究发现MenSCs可以在特定条件下向子宫内膜上皮样细胞方向分化。2018年Zheng[21]等人研究表明MenSCs不仅可以在体外诱导分化为子宫内膜样细胞，而且可以在体内分化为非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠的子宫内膜组织，为MenSCs治疗IUA提供了理论依据。
2.4.2 体外诱导MenSCs向子宫内膜细胞方向定向分化
2017年Jiang[20]等人将MenSCs与子宫内膜间质细胞共培养，同时补充10ng/ml TGF-β1、10ng/ml EGF及10ng/ml PDGF-BB及10-7mol/L 17β-E₂，成功将MenSCs体外诱导分化为子宫内膜上皮样细胞。2018年Zheng[21]等人将MenSCs置于包含了5%胎牛血清、10ng/ml TGF-β、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF-BB及10-8 mol/L 17β-戊酸雌二醇的低糖DMEM中，成功将其诱导分化为子宫内膜样细胞。
2.4.3临床应用MenSCs
(1)优势：① MenSCs具有体外多能性，能分化为三个胚层的细胞[22]； ②MenSCs具有极强的增殖能力，可以通过40次传代维持相对稳定的核型[23]；③MenSCs通过无创方式获取，不存在伦理争议；
(2)局限性：①MenSCs来源受限；②MenSCs是一个相对混杂的细胞群，尚未建立一种纯化细胞群的方法来保持其性状的稳定性[24]。
2.5 脂肪间充质干细胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, ADSCs）
ADSCs来源于中胚层，存在于白色脂肪组织内的血管周围，是脂肪组织脂肪形成和扩张的生理来源，为生物体增加能量摄入期间所需要。
2.5.1 ADSCs应用于子宫内膜再生修复的研究现状
2017年叶明侠[25]等人研究表明接受γ射线照射后的ADSCs，其增殖能力减弱，但仍能够促进子宫内膜细胞的再生。2018年Sun[26]等人将ADSCs片移植入子宫内膜损伤大鼠模型的子宫角内，结果显示部分ADSCs在大鼠模型的子宫内膜中分化为子宫内膜间质细胞，并且子宫角中的ADSCs还促进了子宫内膜细胞、肌细胞的再生，刺激了血管的生成。 
2.5.2 临床应用ADSCs
ADSCs相较于其他干细胞而言，具有以下独特优势：（1）脂肪组织储量丰富、来源充足，脂肪组织中间充质干细胞含量丰富，从脂肪组织中可获得比等量骨髓多500倍的干细胞；（2）获取方法简单，通过吸脂手术即可获得，对供者损伤极小；（3）更容易实现自体移植，免去伦理争议及免疫排斥的问题；（4）与骨髓间充质干细胞相比，衰老更晚，有更为优越的增殖及分化能力，分化范围涵盖了三个胚层；（5）具有免疫调节作用，ADSCs与其他细胞共移植后可有效降低受体的免疫排斥反应从而显著提高移植物的存活周期。而且这种免疫调节作用不仅适用于同种异体移植，对异种间的移植也有同样效果[27]。
综上所述，干细胞疗法为IUA患者子宫内膜修复带来了希望，其中ADSCs是较为理想的种子细胞，然而目前关于ADSCs应用于子宫内膜修复的研究较少，ADSCs的最佳移植途径、治疗剂量、移植时机及潜在致瘤性等问题尚待解决，将ADSCs应用于临床治疗IUA还需要更多更加深入的基础及临床实验。
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