菌落总数质控样的研制及其在能力验证中的应用研究

陈怡文¹，赵萌¹，刘雅丹¹，张晓东¹，项欣华¹，崔生辉*

(中国食品药品检定研究院，北京100050)

摘要: 目的  研制出均匀性和稳定性符合能力验证要求的质控样品,并将质控样品用于菌落总数的能力验证。方法  本次考核样品由高浓度(3×10⁴ CFU)、低浓度(1×10⁴ CFU)两个样品组成，随机抽取质控样品进行稳定性及均匀性的检验，对其进行评价。本设计通过对实验室进行随机分组来发放样品，防止能力验证活动中各实验室进行串通。结论  65家实验室参加本次考核活动，整体满意率为80%，本次能力验证可以真实地反映参试单位的检测水平。本次菌落总数能力验证样品同时可用于质控样使用。

关键词：菌落总数；能力验证；质控样

The Studies of the Quality Control Samples of Aerobic Plate Count and the Application in Application in the Proficiency Test

Chen Yiwen¹, Zhao Meng¹, , Liu Yadan¹, Zhang Xiaodong¹，Xiang Xinhua¹, Cui Shenghui*

(1.National Institutes for food and drug control, Beijing 100050)

ABSTRACT: Objective  To prepare the quality control samples that can meet the requirements of the proficiency test, and to apply the sample in the proficiency test. Methods  Design an testing sample including two concentrations, 1×10⁴ CFU levels and 3×10⁴ CFU levels. Test the stability and uniformity randomly of the samples. The participating laboratories were randomly divided into three groups, each group got different quality control samples. Conclusion  65 labs attended the proficiency test, 80% of the labs with excellent results. The quality control sample can meet the requirements of the proficiency test and the proficiency test could reflect the real testing capacity.

Keywords: Aerobic plate count; proficiency test；quality control samples;

1. 前  言

菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（ml）食品中形成的微生物菌落总数^[1]。菌落总数测定是用来判定食品样品被微生物污染的程度及卫生质量，尤其某些对环境因素（如干燥、加热等）抵抗力强的微生物（如芽孢类）可在食品样品中长期存活，此检测结果常常是食品样品生产加工过程中卫生状况的客观记录，检测结果可用于评价被检样品的卫生学状况，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品样品在生产、运输、储存等环节卫生质量的优劣^[2] 。食品中的菌落总数严重超标，可以反映出其产品的卫生状况不能达到基本的卫生要求，食品失去了食用价值，同时能引起消费者在使用时，引发各种肠道疾病，可能出现呕吐、发烧、腹泻等症状，严重危害消费者身体健康。对菌落总数进行检测，具有卫生学意义。

能力验证(Proficiency Testing)是利用实验室间的比对确定实验室的校准、检测能力或检查机构的检测能力^[3]。实验室比对通过2个或以上的实验室对相同或相似的样品进行检测，对参试结果进行评价，是国际通行的实验室质量控制和认可机构确认实验室能力的有效技术手段。ISO/IEC17025:2005 规定实验室需对其检验能力进行证明 ^[4]。而实验室间比对作为一个独立的手段可以证明实验室检验结果的可靠性^[5]。参加比对实验室可根据结果中反映出的问题，及时采取纠正措施，进一步提高在食品领域的检测水平，纠正自身存在的问题^[6]。

质控样品的均匀性和稳定性是能力验证项目实施的关键，本研究通过控制菌落总数样品的均匀性和储藏、运输稳定性来确保质控样品能够满足能力验证的要求。本次能力验证样品，设置了高、低浓度样品进行检测。低浓度接近GB 10765-2010 食品安全国家标准 婴儿配方食品 最高检出限的浓度，根据ISO/TS 22117:2010的结果评价准则对考核的结果进行评价^[7]。

2、材料与方法仪器和设备

2.1  材料

2.1.1  培养基与菌种

  HETO POWER DRY LL1500 冷冻干燥机,METTLER TOLEDO PL2002 电子天平,Thermo1389 生物安全柜,Thermo Scietific  恒温培养箱,FORMA INCUBATED BENCHTOP 恒温摇床,HYC-940 全自动微生物螺旋加样系统。

2.1.2 仪器

  PCA培养基（美国BD公司，批号：24794），TSA培养基（美国BD公司，批号：236950）。能力验证所用菌株为地衣芽孢杆菌 BL63516和蜡样芽胞杆菌CMCC63511。

2.2、方法

2.2.1 质控样的研制及验证

2.2.1.1 质控样的生产制备

 将地衣芽孢杆菌 BL63516和蜡样芽胞杆菌CMCC63511分别划线接种于TSA平板，36 ℃培养过夜。用无菌棉签从平板上刮取菌苔,按1:1000比例加入5%蔗糖-5%脱脂乳粉中，混匀，经过10μm滤膜过滤后，进行冷冻干燥，待冻干后，真空密封于西林瓶中。依此方法制备3×10⁴的高浓度样品和1×10⁴的低浓度样品。

2.2.1.2 样品的均匀性验证

 将25g奶粉混入225mL生理盐水中，充分拍击混匀。随机抽取高、低浓度的质控样品各20瓶，每瓶加入1 mL 生理盐水，将质控样充分溶解，混匀后，加入225mL混合样中，拍击混匀。进行10倍系列梯度稀释，取原液，10^-1,10^-2 菌悬液1mL加入空白平板中，用PCA培养基倾注平板，混匀，静置10min后，置于36 ℃±1 ℃培养18~24 h。进行菌落计数。

2.2.1.3 对模拟运输条件的温度监测

菌落总数质控样运输包装的方式是采用加冰袋的厚泡沫箱运输,放置室温环境模拟运输环境。泡沫箱厚度为6 cm,冰袋重量为1.5 kg,用胶带对泡沫箱进行密封,放置于室温环境，应用DataTrace 系统对泡沫箱内温度变化进行实时监控。

2.2.1.4 运输条件稳定性模拟实验

一般样品能够保证在三天内发送至全国各地，考虑到实际可能发生的各种情况，模拟实验周期设为1 周。高、低浓度样品分别保存在37 ℃，25 ℃和4°C环境下，每次随机挑选3个样品进行实验。以验证运输时菌落总数质控样的稳定性能否满足考核要求。

2.2.1.5 储藏稳定性的模拟实验

收到考核样后，推荐保存温度为-25°C。将制备的高、低浓度质控样保存于-25 ℃，于发样前和收到结果后，随机挑选3个样品进行实验。

2.3 考核方案的设计

2.3.1 考核样品

考核样品包括2瓶菌落总数样品，2袋25g奶粉样品。考核样品设置2个浓度水平，奶粉于60°C烘烤3天进行处理。

2.3.2 样品的发放

对全国65家实验室进行样品发放。将发放的样品西林瓶固定在有海绵缓冲的小方盒中,再置于塑封袋中,放入泡沫箱，在箱中加入1.5 kg 的冰袋和干冰,用胶带密封好,放入运输箱中。

2.3.3 测定方法

参照GB4789.2-2016 食品安全国家标准食品 微生物学检检验 菌落总数测定对质控样品进行检测,实验室根据日常检测的要求选择培养基进行检测。

2.3.4 防止数据串通的措施

对实验室进行随机编码，并将打乱的编码随机分为3组, 各实验室需报告2个样品菌落总数及其对应的样本编号。每组可能收到样品组合可能为高、高浓度，低、低浓度和高、低浓度。因为分组采样随机分组，则各实验室之间的结果不能互相作为参考，可以有效的防止实验室间的数据串通。

2.2.5 结果的评价原则

对实验室报送的结果,经过对数转换后按下列公式计算| z |值：

z =（x-X）/σ

式中：x-实验室测试结果

X-指定值

σ-变动性度量值

“满意”结果应符合：2个浓度样品结果 | z |≤2；或1个结果2＜| z|＜3； “不满意”结果为任意浓度样品结果| z|≥3；或2组浓度样品结果2＜| z|＜3；

3 结果

3.1 质控样均一性和稳定性检验结果

3.1.1 样品均匀性的检验结果

高浓度样品均匀性检测结果,对20瓶菌落总数质控样品进行检测显示,样品中菌落总数的平均量为3.34E + 04CFU。 FINV（0.05，19，20）临界值=2.137009，根据SPSS软件计算的结果F=1.193<FINV（0.05，19，20）临界值，表明该样品符合均匀性的要求。

低浓度样品均匀性检测结果，对20 瓶菌落总数质控样品进行检测显示,样品中菌落总数的平均量为1.05E+04CFU。FINV（0.05，19，20）临界值=2.137009，根据SPSS软件计算的结果F=1.027<FINV（0.05，19，20）临界值，表明该样品符合均匀性的要求。

3.1.2 运输条件模拟实验的温度监测结果

模拟运输条件,泡沫箱内的温度变化如图1 所示,在室温为25°C时，根据图1的温度变化曲线可以发现，在3天内保证样品处于4℃以下。发送样品的时间为10月中旬，实际的运输条件下，温度一般不会达到在36℃。结合运输稳定性数据，本次样品能够满足能力验证对运输稳定性的要求。

图1  6cm泡沫加1.5kg冰袋于25°C放置的温度变化曲线

3.1.3 质控样品运输稳定检验

根据CNAS-GL03 能力验证样品均匀性和稳定性评价指南中5.3 ｜ x(—)-y(—)｜  ≤ 0.3σ 准则进行判定，式中：x(—)为均匀性检验的总平均值； y(—)为稳定性检验时，对随机抽取的样品测量平均值；σ 为该能力验证计划的能力评价标准偏差目标值，根据以往的能力验证经验，根据本次样品中的菌的含量将σ确定为0.25，0.3σ值为0.075。在25℃条件下，高浓度样品3天内考核样的稳定性情况良好，而第5天稳定性降低，出现不稳定现象；低浓度样品14天内稳定情况均良好。在37°C条件下，高浓度样品第5天出现一次不稳定情况，低浓度样品14天内稳定情况均良好。 在4°C条件下，高浓度和低浓度样品，14天内数值均保持稳定。

表1高、低浓度样品运输稳定性

Table 1  the stability of sample with high and low concentrations