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蒲公英中绿原酸酶法提取工艺及其对圣女果保鲜效果研究
陈旭
（武汉设计工程学院，武汉430205）
摘 要：以蒲公英为原料，利用纤维素酶提法提取蒲公英中的绿原酸成分，研究料液比、酶解温度及酶解时间，纤维素酶的添加量的变化，对蒲公英中绿原酸提取率的影响，从而得到最佳的提取工艺。实验结果表明：纤维素酶的添加量为0.8%，料液比为1:16，酶解温度为40℃，酶解时间为90min。将不同浓度绿原酸喷洒到圣女果表面，对绿原酸的保鲜效果进行研究。结果表明：绿原酸能有效延长圣女果贮藏保鲜时间，降低圣女果的失重率、减少可溶性固形物、Vc含量、可滴定酸含量的损失。同时50mg/L的绿原酸保鲜效果比25mg/L的绿原酸保鲜效果好。
Research on the extraction process of chlorogenic acid in dandelion enzyme method and its fresh-keeping
effects on Cherry Tomatoes
CHEN Xu
（Wu Han Institute of Design and Science, Wuhan 430205, China）
Abstract：The experiment with dandelion as raw material, the use of cellulase extraction process of chlorogenic acid in the extraction of the dandelion, research material liquid ratio, enzyme solution temperature and solution time, the change of the cellulose enzyme content, the impact on the dandelion extract chlorogenic acid content in, to get the best extraction process. Experimental results show that the cellulose enzyme addition amount of 0.8%, ratio of feed liquid 1:16, enzymolysis temperature of 40 ℃, enzymolysis time of 90 min. ; Different concentrations of chlorogenic acid were sprayed on the surface of cherry tomatoes to study the fresh-keeping effect of chlorogenic acid on cherry tomatoes. The results showed that chlorogenic acid could effectively prolong the storage and preservation time of cherry tomatoes, reduce the weight loss rate of cherry tomatoes, reduce the loss of soluble solids, Vc content and titrable acid content. At the same time, chlorogenic acid at 50mg/L has better preservative effect than chlorogenic acid at 25mg/L
Keywords: Taraxacum mongolicum; chlorogenic acid; Cherry Tomatoes; orthogonal test; vitamin C
蒲公英（拉丁学名：Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）菊科，蒲公英属多年生草本植物。根圆锥状，表面棕褐色，皱缩，叶边缘有时具波状齿或羽状深裂，基部渐狭成叶柄，叶柄及主脉常带红紫色，花葶上部紫红色，密被蛛丝状白色长柔毛；头状花序，总苞钟状，瘦果暗褐色，长冠毛白色，花果期4～10月。根据我国植物志记载，蒲公英属有两千多种，在中国分布有七十多种，广泛分布于东北、华北、华中、西北和西南各省。蒲公英味苦甘，性寒，归肝、胃经，为中医或民间常用药。古方有载蒲公英为“解热凉血之要药”，能够清热解毒，有消痴散结、清湿热的功能。常用于治疗多种炎症、便秘、胃痛、痛肿、高血脂、肿瘤及前列腺类疾病。蒲公英植物体中含有多种活性成分如黄酮类化合物、三萜类化合物、绿原酸等，蒲公英可生吃、炒食、做汤，是不可多得的药食两用的植物。
绿原酸作为一种酚类化合物存在于蒲公英中，它易溶于乙醇。绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[1]。因此，蒲公英绿原酸的提取分离以及应用研究引起了人们的极大关注。越来越多的学者开始研究绿原酸的提取工艺。目前提取绿原酸的方法有多种，比如：水提法，物理场强化提取法，醇提法，微波提取法，酶解-超声组合法，膜技术分立法，酶法，超临界萃取法等[2]。
每种提取绿原酸的方式，都有其各自的优缺点。但是利用纤维素酶提取蒲公英绿原酸，再用分光光度测定绿原酸的含量，即使提取率没有其他方法的高，但反应条件容易控制，且绿原酸不容易和无机试剂反应，失去活性，而且不会残留无机溶剂，更加适用于食品的贮藏保鲜。因此，本文利用纤维素酶法替代有机溶剂提取蒲公英中的绿原酸[3]。
圣女果是番茄的一个品种。圣女果中含有番茄红素、维生素、矿物质等多种营养成分。同时，经常食用圣女果，可以达到健胃、美白、抗衰老的功效。圣女果的果皮薄，果实含水量高，所以在贮运过程中，会发生蒸腾作用，导致果实失水萎蔫，严重会霉变腐烂，很容易失去圣女果的商品价值。低温贮藏的条件，水果容易发生冷害；气调贮藏的条件，耗能高；化学保鲜剂贮藏，易产生残留问题。随着人们的生活质量越来越高，越来越多的人，开始重视食品安全问题[4]。绿原酸具有抗菌、抗氧化、抗病毒等作用。绿原酸对水果的保鲜和防腐效果明显，对圣女果的保鲜研究具有重要的理论和现实意义。
本文研究得到酶法提取蒲公英中的绿原酸最佳的工艺条件，并且将绿原酸运用在圣女果的贮藏保鲜中。通过测定失重率、好果率、可溶性固形物、Vc含量和可滴定酸含量的变化，研究不同浓度的绿原酸对圣女果的贮藏保鲜效果，为新型的保鲜剂的研发提供理论参考。
蒲公英、圣女果、纤维素酶、绿原酸标准品、95%乙醇、氢氧化钠、抗坏血酸、酚酞实验室提供。
数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）、旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、 分析天平（上海越平科学仪器有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、台式高速离心机（长沙湘智离心机仪器公司）。
1.3 实验方法
1.3.1蒲公英绿原酸提取工艺流程
在低温的条件下，烘干粉碎蒲公英。然后将粉碎后的蒲公英过80目筛。
2) 混合
在称取2g蒲公英干粉再加入一定量的纤维素酶和体积分数60%乙醇混合均匀。
3) 水浴
4) 灭酶
当水浴反应一段时间后，立即将锥形瓶用沸水浴灭酶5分钟，并且将锥形瓶冷却至室温。
5) 过滤
用减压过滤装置，过滤样品，并且用少量的体积分数60%乙醇润洗抽滤瓶。
6) 减压浓缩
将过滤好的样品，放进旋转蒸发仪中。调整旋转蒸发仪转速和温度（50℃），时间（20min）得到浓缩液，记录浓缩液体积。
7) 定容
用体积分数60%乙醇，将0.1mL的浓缩液缓慢定容到10mL。
8） 测定
在327nm波长处，测定其吸光度，并且做三次平行，计算绿原酸含量。
1.3.3 蒲公英绿原酸提取工艺研究
以纤维素酶添加量、料液比、酶解温度、酶解时间为影响因素。以绿原酸提取率为评价指标，研究这四个变量对蒲公英绿原酸提取率的影响，确定最佳提取工艺。
以圣女果为研究材料，将圣女果分为9份，每份大概500g，分别用25、50mg/L的绿原酸溶液喷洒在圣女果上，以蒸馏水处理作为对照，自然晾干，重复三组平行。在第1、3、5、7、9、11、13、15天分别测定圣女果的失重率、Vc含量、可滴定酸含量、可溶性固形物含量、好果率，对不同浓度绿原酸对圣女果的保鲜效果进行研究。
1.3.5.1 绿原酸含量的测定
1）绿原酸标准曲线的绘制
绿原酸标准曲线的绘制：称取绿原酸标准品6.30mg，用0.2mol/L盐酸定容到50mL。然后分别移取不同体积的绿原酸溶液（0.30，0.50，0.70，0.90，1.10，1.30mL），用0.2mol/LHCL定容至10mL，在325nm波长处测定吸光度，最后制作成标准曲线。
2）绿原酸含量的测定方法
用体积分数为60%乙醇溶液将0.1mL样品液定容至10mL，以体积分数为60%的乙醇溶液作参比，于327 nm 处测定吸光度，然后根据下式计算绿原酸提取率[5]。
绿原酸提取率（%）=
（1-1）
式中：C—用标准曲线计算出测定样液的质量浓度（mg/L）；
V2—测定吸光度时样液的定容体积（mL）；
V1—提取液总体积（mL）；
V0—测定吸光度移取样液的体积（mL）；
W—样品重量（g）
1.3.5.2 失重率的测定
采用称重法，隔一天同一时间，称量各组圣女果总质量，得到样品失重率W(%)。
（1-2）
1.3.5.3 好果率的测定
使用观察法，隔一天同一时间，观察各组圣女果好坏果数量。
好果率
（1-3）
1.3.5.4 可滴定酸含量测定
根据国标GB/T 12293-90进行测定。
1.3.5.5 可溶性固形物含量的检测
称取5.0g圣女果研磨离心（4000r/min，10min）用手持式折光仪测定折射率[6]。
1.3.5.6 维生素C含量的测定
1）维生素C标准曲线的绘制
移取不同体积的100μg/mL维生素C标准溶液(0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL)，用蒸馏水定容到50mL。蒸馏水作为空白对照组，在243nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
2）维生素C含量的检测方法
在研钵中加入10mL1%HCl，称取10g圣女果研磨成浆液，定容到50mL，离心10min，取上清液为待测提取液。在50mL容量瓶中，先加入2mL10% HCl，再加入1.0mL待测提取液，用蒸馏水定容。以蒸馏水为空白，在243nm处测定吸光度。移取1.0mL待测果蔬提取液、10mL蒸馏水和4mL 1mol/LNaOH溶液放入50mL容量瓶中，摇匀，静置20min后加入4mL10%HCl,混匀，用蒸馏水定容。用蒸馏水作为参比溶液，在243nm测定其吸光度。圣女果维生素C含量的吸光度是待测果蔬提取液和碱液处理果蔬提取液的吸光度之差。带入公式可得到圣女果中维生素C的含量(mg/100g)[7]。
（1-4）
式中：C—为依标准曲线方程计算得到的维生素C浓度（μg/mL）；
V1—为测吸光度时吸取样品溶液的体积（mL）；
V总—为吸取样品定容总体积（mL）；
V待测总—为待测样品总体积（mL）；
W总—为果蔬质量（g）；
100—为100g果蔬。
绿原酸标准溶液的回归方程为y=0.5611x-0.0036相关系数r2=0.993，呈良好的线性关系。
图2-2 纤维素酶的添加量对绿原酸提取量的影响
由图2-2可知，蒲公英绿原酸的提取率，随纤维素酶的添加量的增加，绿原酸提取率呈现先上升后下降的趋势。纤维素酶的添加量从0.8%到1.0%时，绿原酸的提取率逐渐升高达到最高值。这可能是由于纤维素酶浓度增高，能够充分的分解蒲公英细胞壁中的纤维素，绿原酸更好的溶出。所以选取纤维素酶添加量为1%为提取的最佳添加量。选取纤维素酶的添加量为0.8%、1%、1.6%这3个水平进行正交试验结果分析。
2.1.3 酶解温度对绿原酸提取率的影响
图2-3 酶解温度对绿原酸提取率的影响
由图2-3可知，蒲公英绿原酸的提取率，随酶解温度的升高呈现先上升后下降的趋势。当反应温度低于50℃时，随着温度的升高，纤维素酶的活性，逐渐变高，其绿原酸的提取率逐渐增加，在50℃的时候，酶的活性最强，绿原酸的提取率达到了最大值。当酶解温度超过50℃时，蒲公英绿原酸的提取率，稳定性下降。可能是因为酶的活性受反应温度的影响，温度过高酶失活。同时，温度过高，绿原酸受热被破坏。因此选取酶解温度30℃、40℃、50℃这3个水平进行正交试验结果分析。
|
2.1.4 酶解时间对绿原酸提取率的影响
图2-4 酶解时间对绿原酸提取率的影响
由图2-4可知，蒲公英绿原酸的提取率，随酶解时间的延长呈现先上升后下降的趋势。酶解时间在0~1.5h范围内，蒲公英绿原酸提取率逐渐增加，这是因为随着酶解时间的延长，纤维素酶能充分的和蒲公英反应，使绿原酸能够更好的被提取出来。因此选取酶解时间1h、1.5h、2h这3个水平进行正交试验结果分析。
2.1.5 料液比对绿原酸提取率的影响
图2-5 料液比对绿原酸提取率的影响
由图2-5知，在其他条件不变的情况下，当料液比逐渐增加，绿原酸的提取率，先增加后逐渐减少。低于1：16时，随着料液比的增加，绿原酸的提取率逐渐增加，这可能是因为乙醇将绿原酸更好的溶出。当料液比超过1：16时，绿原酸提取率稳定下降。可能是因为料液比过高，绿原酸浓度下降。因此选取料液比为1：14g/mL、1:16g/mL、1:18g/mL这3个水平进行正交试验结果分析。
2.1.6 正交实验
按照上述的单因素实验所选取的因素和水平进行正交试验，如下表：
表2-1 正交试验因素水平表
|
水平 |
A酶的添加量 （%） |
B酶解时间 （min） |
C酶解温度 （℃） |
D料液比 （g/mL） |
|
1 |
0.8 |
1 |
30 |
1：14 |
|
2 |
1 |
1.5 |
40 |
1：16 |
|
3 |
1.6 |
2.0 |
50 |
1：18 |
表2-2 蒲公英绿原酸酶法提取正交试验的结果
|
编号 |
A |
B |
C |
D |
提取率 (%) |
|
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1.739 |
|
2 |
1 |
2 |
2 |
2 |
2.349 |
|
3 |
1 |
3 |
3 |
3 |
2.011 |
|
4 |
2 |
1 |
2 |
3 |
2.035 |
|
5 |
2 |
2 |
3 |
1 |
2.248 |
|
6 |
2 |
3 |
1 |
2 |
1.915 |
|
7 |
3 |
1 |
3 |
2 |
1.830 |
|
8 |
3 |
2 |
1 |
3 |
1.805 |
|
9 |
3 |
3 |
2 |
1 |
1.772 |
|
K1 |
6.099 |
5.604 |
5.459 |
5.759 |
— |
|
K2 |
6.198 |
6.402 |
6.156 |
6.094 |
— |
|
K3 |
5.407 |
5.698 |
6.089 |
5.851 |
— |
|
k1 |
2.033 |
1.868 |
1.820 |
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