白藜芦醇胶束在大鼠体内的药动学研究

张纯刚¹，于琛琛¹，唐静雅^2*

（1．辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600；

2．大连医科大学附属第一医院药剂科，辽宁 大连 116011）

摘要：目的  以白藜芦醇原料药为对照，研究白藜芦醇胶束在大鼠体内药动学过程。方法  12只雄性SD大鼠随机分为2组，每组6只，分别灌胃给予白藜芦醇原料药及白藜芦醇胶束，两组均按白藜芦醇20 mg·kg^-1的剂量给药，高效液相色谱法测定白藜芦醇在大鼠体内血药浓度变化。血药浓度数据采用DAS 3.0药动学软件进行处理，确定药动学参数。结果  大鼠给予白藜芦醇原料药及白藜芦醇胶束后，白藜芦醇药-时曲线均符合二房室模型，与白藜芦醇原料药组相比，白藜芦醇胶束组的C_max，AUC_0-12显著增大，白藜芦醇胶束组的相对生物利用度为158 %。结论  以泊洛沙姆188为载体将白藜芦醇制成胶束后能显著提高白藜芦醇在大鼠体内的生物利用度。

关键词：白藜芦醇；胶束；高效液相色谱法；药代动力学；相对生物利用度

Pharmacokinetics of Resveratrol Micelle in Rats

ZHANG Chun-gang¹, YU Chen-chen¹, TANG Jing-ya^2*

(1. College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning Dalian, 116620, China

2. Department of Pharmacy, The first hospital affiliated to dalian medical university, Liaoning Dalian, 116011, China)

Abstract:  Objective The aim of this article was to study the pharmacokinetics of resveratrol micelle formulation in rats． Methods Male SD rat (n = 12) were randomly divided into two groups (n = 6)．The rats were administrated resveratrol and resveratrol micelle formulation respectively, the two groups were fed in the same dosage of resveratrol (20 mg·kg^-1)．The concentration of resveratrol in plasma were determined by high performance liquid chromatography．The software of DAS3.0 was used to process the pharmacokinetic parameters． Results The concentration-time profiles of resveratrol and its micelle formulation conformed to two compartment model. The total areas under the plasma concentration-time curve AUC_0-12 were larger than that of crude drug and its bioavailability was 158 %.  Conclusions The resveratrol micelle formulation could increase bioavailability in rats in vivo remarkably.

Key words: Resveratrol; Micelle; HPLC; Pharmacokinetics; Relative bioavailability

白藜芦醇（Resvratrol，RESV）是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，广泛存在于葡萄、松树、虎杖、决明子和花生等天然植物或果实当中^[1]。它是许多植物受到生物或非生物胁迫（如真菌感染、紫外照射等）时产生的一种植物抗毒素, 具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能^[2-4]。由于白藜芦醇具有难溶于水、半衰期短、代谢和消除速率快、生物利用度低、稳定性差等特性，限制了其临床应用^[5-7]。白藜芦醇难溶于水，透膜率高，生物药剂学分类机构将其认定为Ⅱ类化合物。这种小分子药物的生物利用度取决于药物的水溶性、透膜率和代谢的稳定性。因此近年来对白藜芦醇的研究大多集中在制备新剂型，以达到提高其稳定性、水溶性的目的。两亲性共聚物在溶液中可自组装成特定的超分子有序聚集体—胶束，形成一种澄清、稳定的液体制剂，有助于增加脂溶性药物的溶解度，增加药物的生物利用度。

本研究根据白藜芦醇的性质和疏水特性, 以泊洛沙姆188（poloxamer188）为载体将其制成胶束，旨在提高白藜芦醇的水溶性、稳定性并使其消除减缓、半衰期延长，提高生物利用度，进而拓展白藜芦醇的临床应用。并以原料药溶液为参比制剂，研究白藜芦醇胶束在大鼠体内的药动学过程及生物利用度，为白藜芦醇制剂的开发提供依据。

1 仪器与材料

1.1仪器  日本岛津2010A液相色谱仪（UV 检测器，岛津色谱工作站），AY220电子分析天平（SHTMADZU），涡旋混合器Vortex-5（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），高速离心机TGL-16g（上海安亭科学仪器厂），微量移液器（大龙医疗设备有限公司），DAS3.0统计计算软件（中国药理学会数学药理专业委员会）。

1.2试药  白藜芦醇标准品（含量质量分数 98 %，批号111535-201502，南京森贝伽生物科技有限公司），卡马西平对照品（含量质量分数99 %，批号100142-201605，上海哈灵生物科技有限公司），白藜芦醇原料药（武汉远成赛创科技有限公司），白藜芦醇羟丙基-β-环糊精包合物（自制），醋酸（天津市科密欧化学试剂有限公司），乙腈（色谱纯，美国Sigma试剂有限公司）。

1.3动物  Sprague Dawley（SD）大鼠，共12只，雄性，体质量250 ± 20 g由辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物使用许可证号SCXK（辽）2015-0001。

2 方法与结果

2. 1 溶液的制备  由于白藜芦醇对光不稳定，以下过程采取避光操作。

2.1.1白藜芦醇对照储备液及系列标准溶液  取白藜芦醇对照品适量，精密称定为10.2 mg，置250 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度， 摇匀， 获得白藜芦醇质量浓度为40.8 μg•mL^-1的对照储备液。用甲醇稀释上述对照储备液， 获得质量浓度依次为100、200、510、1020、2040、5100、10200、25500 ng•mL^-1的系列标准溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.1.2 白藜芦醇系列质量控制溶液  取白藜芦醇对照品适量，精密称定为10.0 mg，置250 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀， 获得白藜芦醇质量浓度为40.0 μg•mL^-1的对照储备液。用甲醇稀释上述对照储备液，获得质量浓度依次为250、4000、20400 ng•mL^-1的系列质量控制溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.1.3 内标溶液  取卡马西平对照品适量，精密称定为10.1 mg。置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1.01 mg•mL^-1 卡马西平储备液。精密量取一定体积的卡马西平储备液，用甲醇稀释得浓度为25 μg·mL^-1的内标溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。

2.2 色谱条件  色谱柱为Agilent Extend C₁₈ 柱（150 mm X 4.6 mm, 5 μm）；预柱为 Phenomenex C₁₈柱（4.0 mm X 2.0 mm）；流动相为乙腈-水（30:70, v/v）；流速为1.0 mL• min^-1；进样量是30 µL；检测波长为320 nm；柱温是室温。

2.3 血浆样品预处理  由于白藜芦醇对光不稳定，以下过程采取避光操作。取血浆100 μL，依次加入甲醇10 μL，内标溶液 10 μL，加入0.5 %醋酸50 μL，加入乙腈200 μL，涡旋混合5 min。12000 rpm离心10 min，取30 μL上清液进行分析。

2 .4 分析方法的确证

2.4.1方法的专属性考察  分别取6只SD大鼠空白血浆100 μL，将加入内标溶液10 μL改为加入甲醇10 μL，其余按“2.3血浆样预处理”项下的方法操作，得空白血浆样品色谱图，得图1A；将白藜芦醇定量下限标准溶液（质量浓度为0.10 g·L^-1）和内标溶液加至空白血浆中，依同法操作，得色谱图，如图1B，其中白藜芦醇和内标（卡马西平）的保留时间分别为3.86和7.25 min；取经口服给药后收集的血浆样品，依同法操作，得色谱图，如图1C。结果表明，血浆中内源性物质不干扰白藜芦醇和内标（卡马西平）的测定。

 (A) 大鼠空白血浆;(B) 大鼠空白血浆加白藜芦醇和内标物;(C) 受试动物给予白藜芦醇后0.5 h的血浆样品

图1  HPLC法测定血浆中白藜芦醇(Ⅰ)和内标(Ⅱ)的典型色谱图

2.4.2 标准曲线和定量限  取100 μL大鼠空白血浆, 加入白藜芦醇系列标准溶液10 μL，配制成相当于白藜芦醇质量浓度为10、20、51、102、204、510、1020和2550 ng•mL^-1的血浆样品，其余按“2.3血浆样品预处理”项下的方法操作，同一质量浓度进行双样本分析，记录色谱图。以血浆中待测物浓度（C，ng•mL^-1）为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值（A）为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线。结果表明，白藜芦醇在10~2550 ng•mL^-1范围内线性关系良好，血浆样品的典型标准曲线回归方程为：y = 0.0057x + 0.1068 ( r = 0. 9982)，最低定量限（Lower limit of quantification，LLOQ）为质量浓度10 ng•mL^-1，可满足 SD大鼠体内白藜芦醇测定的要求。

2.4.3方法精密度和准确度  取空白血浆100 μL，加入白藜芦醇系列标准溶液10 μL，配制白藜芦醇低、中、高三个质量浓度（25、400和2040 ng•mL^-1）的质量控制（quality control，QC）样品，除少加甲醇10 μL外，其余按“2.3血浆样品预处理”项下的方法操作，每一浓度进行6样本分析，连续测定三天，以当日标准曲线计算QC样品的测定浓度，与配制浓度对照，计算本法的精密度和准确度，结果见表1。方法的准确度与精密度均符合生物样品测定的相关要求。

表1 HPLC法测定大鼠血浆中白藜芦醇的准确度和精密度

2.4.4提取回收率  取空白血浆100 μL，加入白藜芦醇系列质量控制溶液10 μL，配制白藜芦醇低、中、高三个质量浓度（25、400和2040 ng•mL^-1）的QC样品，除少加甲醇10 μL外，其余按“2.3血浆样品预处理”项下的方法操作，每一浓度进行6样本分析，记录得到色谱图，得白藜芦醇经提取的峰面积记为A；同时另取大鼠空白血浆100 μL，加入甲醇10 μL，乙腈200 μL，涡旋混合5 min。12000 rpm离心10 min，取空白上清液，加入相应浓度和体积的白藜芦醇标准溶液和内标溶液，涡流混合，进样分析，每一浓度进行3样本分析，记录平均值B。以A与B的平均值计算白藜芦醇的提取回收率，白藜芦醇在25、400和2040 ng•mL^-1三个质量浓度的血浆样品提取回收率分别为98.1%、102.2%和99.6%。依法测得内标的提取回收率为101.2%。

2.4.5样品的稳定性  本实验考察了白藜芦醇血浆样品室温放置2 h、处理后进样室温（4 ℃）放置24 h、经历1次和3次冷冻-解冻循环和-20 ℃冰冻30 d的稳定性。进行稳定性考察时，取空白血浆100 mL，加入白藜芦醇低、中、高三个质量浓度的系列质量控制溶液10 μL，配制成低（25 ng•mL^-1）、中（400 ng•mL^-1）和高（2040 ng•mL^-1）的3个质量浓度的QC样品，每一浓度进行6样本分析。实验结果说明白藜芦醇血浆样品在避光条件下室温放置2 h、处理后进样室温（4 ℃）放置24 h、经历1次和3次冷冻-解冻循环和-20 ℃冰冻30 d均可保持稳定（相对偏差均在±15 %之内），数据见表2。

表2  在不同条件下白藜芦醇样品的稳定性

2.5 分析方法在药动学中的应用

2.5.1 给药方案与样品采集  取雄性Sprague Dawley大鼠12只，随机分成两组，每组6只。由于白藜芦醇对光不稳定，以下过程采取避光操作。实验前禁食12 h，自由饮水，次日晨分别口服灌胃白藜芦醇原料药（20 mg•kg^-1）和白藜芦醇胶束。分别于给药前（0 h）和给药后0.083, 0.167, 0.25, 0.33, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8和12 h于眼底静脉丛采血约200 μL，置肝素化离心管中，3500 rpm离心10 min，分离血浆，冷冻保存在-20 ℃冰箱中待测。

2.5.2 药动学研究  实际生物样品测定过程中，同时配制低（25 ng•mL^-1）、中（400 ng•mL^-1）和高（2040 ng•mL^-1）的3个质量浓度的QC样品，将QC样品以及各时间点血浆样品，按“2.3”条方法处理和测定，代入当日建立的随行标准曲线计算得到各时间点血浆样品中白藜芦醇质量浓度，获得平均血药质量浓度-时间曲线见图2。血药质量浓度-时间数据经 DAS 3.0药动学软件处理，C_max和T_max均采用实测值采用梯形法计算AUC_0-12值；AUC_0-¥是由AUC_0-12加上由t外推至无穷大的曲线下面积（C_t /k_e）计算求得；k_e用对数血浆药物浓度-时间曲线末端直线部分的斜率求得；末端消除半衰期（t_1/2）= 0.693/k_e；白藜芦醇胶束制剂相对白藜芦醇原料药的相对生物利用度按 F 相对=(AUCT×DR)/ (AUCR×DT)×100%计算（T 和 R 分别代表原料药和制剂）。药物动力学参数见表3。

表3  白藜芦醇在大鼠体内主要药动学参数（meaan±sd，n=6）

图2  白藜芦醇在大鼠体内的平均血浆药物质量浓度-时间曲线对比图

3 讨论

    大鼠分别灌胃给予白藜芦醇原料药及白藜芦醇胶束后，白藜芦醇分别在 5和15 min左右血药浓度达峰，说明白藜芦醇胶束在大鼠体内迅速吸收入血。RESV原料药组Cmax为473.3±200.8 ng/ml，白藜芦醇羟丙基-β-环糊精包合物组为1082.9±563.6 ng/ml，提高了2倍多。与原料药组相比，胶束组可以较快达到有效浓度。与白藜芦醇原料药组相比，白藜芦醇胶束组AUC_0-12是白藜芦醇原料药组的1.58倍，说明白藜芦醇制成胶束后生物利用度提高。这是因为白藜芦醇制成胶束后，水溶性增加，溶解度增大，白藜芦醇在大鼠体内容易被吸收。以泊洛沙姆188为载体将白藜芦醇制成胶束后能显著提高白藜芦醇在大鼠体内的生物利用度。白藜芦醇胶束组出现双峰现象有可能为胶束在胃中析出，排空进入肠中后再次被吸收，此种现象有待进一步研究。

参考文献

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