猪肝和羊肝粗提物抑制蛋白质聚沉与抗氧化的研究

董晶晶¹，梁艳敏¹，李品¹，赵翠梅¹，刘艳琴^*1，龚建刚^*2

（1.河北农业大学理工学院，河北沧州 061100；2.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071000）

摘要：动物肝脏是肉类加工中的副产物，含有丰富的维生素和矿物质，具有养血补肝，明目的功效。本文采用猪肝和羊肝作为研究对象，对两种物质抑制蛋白质聚沉及抗氧化活性进行研究。本试验选用磷酸缓冲溶液作为提取剂对样品进行提取，采用浑浊度法利用96孔微量平板来测定动物肝脏粗提液对蛋白质聚沉的影响，运用水杨酸法测定肝脏粗提液的抗氧化活性。结果表明，羊肝粗提液对蛋白质聚集有较为良好的抑制作用，抑制率为82.56%。同时，两种样品都具有抗氧化作用，羊肝抗氧化率达到89.49%，猪肝抗氧化率为87.28%。

关键词：动物肝脏；蛋白质聚沉；抗氧化

中图分类号：        文献标志码：            文章编号：

动物肝脏是动物体内储存养料和解毒的重要器官^[1]，含有丰富的营养物质，具有营养保健功能。中医记载，动物肝脏味甘，苦，性凉，具有补肝明目，益气补血的功效^[1]。据《传信方》等记载，动物肝脏可治血虚萎黄，赢瘦无力，肝虚目暗，雀目^[2]，目赤肿痛，障翳等疾病。动物肝脏中铁质丰富，可以调节改善贫血人造血系统的生理功能，丰富的维生素B_2,对补充机体重要的辅酶，完成机体对医学有毒成分的去毒有重要作用，含有的维生素C、微量元素硒，能够抗氧化，抗衰老，增强人体免疫功能^[3]，同时抑制肿瘤细胞的产生。除此之外，还含有丰富的维生素A，能够保护眼睛，防止眼睛干涩疲劳^[4][5]，对于维持视力具有一定的作用，所以有人们所熟知的肝“明目”的说法。

我们所熟知的白内障疾病是由于多种因素共同作用，导致晶状体浑浊而视物不清^[6]，其中氧化应激，紫外线照射和离子辐射等均可使晶状体蛋白变性^[7]，而导致白内障疾病的发生。而研究发现，变性是蛋白质聚沉的先决条件。蛋白质聚沉是蛋白质错误折叠，组装和转运的结果。到目前为止，白内障疾病主要是在前期进行药物治疗减缓病情，疾病后期只能进行手术治疗^[8]。而迄今为止，市面上没有很好的药物可以有效的治疗白内障，早期白内障可以通过口服维生素B₂、维生素C等延缓病情^[8]。本文中，选取羊肝与猪肝两种物质作为试验材料，对动物肝脏对蛋白质聚沉和抗氧化的作用进行研究，希望从而推广到对于白内障疾病的预防中。

1  材料和方法

1.1  材料与试剂

羊肝与猪肝，购自黄骅市海源市场；二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠，胰蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司；硫酸亚铁固体、水杨酸固体，天津市科密欧化学试剂有限公司；95%乙醇，天津市北辰方正试剂厂；30%过氧化氢，天津市东方化工厂。

1.2  仪器与设备

HC-3018R型高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；CP313电子天平，奥豪斯仪器有限公司；FK-A(JJ-2)组织捣碎机，常州普天仪器制造公司；90-1数显磁力搅拌器，上海青浦沪西仪器厂；KQ22000E型超声波清器，昆山市潮汕仪器有限公司；DNM-9602型酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司；SHP生化培养箱，北京中兴伟业仪器有限公司；PHS-2C实验室pH计，奥豪斯仪器有限公司，Castar品牌聚苯乙烯96孔板,美国康宁公司。1.3  方法

1.3.1  粗提液的制备

  用电子天平称取两种样品各50 g，用蒸馏水冲洗10分钟，在水中浸泡30分钟，切碎，用量筒量pH为7的磷酸缓冲溶液各100 mL,将样品与缓冲溶液按照固液比1:2放入FK-A(JJ-2)组织捣碎机中，从小到大改变捣碎机的转速以保证样品能彻底粉碎成匀浆状态，取出后放入离心管中配平后放在高速冷冻离心机中，在4℃，12000 r/min状态下离心20分钟，离心完成后取上清液，离心后的样品中含有油脂，用石油醚进行脱脂，完成后，放入4℃冰箱中保存备用。

1.3.2  96孔微量平板法对蛋白质聚沉的测定

将样品粗提液取出，进行解冻，放入1 mL离心管中。将蛋白质溶液，样品粗提液在4 ℃，12000 r/min条件下进行离心，20分钟后取出。取出上清液后，将样品过0.2 μm孔径滤器备用。

用20 uL-200 uL移液枪在96微量平板板中进行加样，蛋白组100 uL trypsin溶液加100 uL 磷酸缓冲溶液，蛋白对照为200 uL磷酸缓冲溶液，样品组100 uL样品粗提液加100 uL trypsin溶液，样品对照组为100 uL样品粗提液加100 uL磷酸缓冲溶液，每组重复3次作为平行。加样完成后，将96孔微量平板放入酶标仪中，在波长为405 nm条件下进行测定，记录数据，在生化培养箱中37 ℃条件下进行培养，每两个小时测量一组数据，记录数据，计算3次数据的平均值，与对照组比较并进行分析。

1.3.3  水杨酸法对抗氧化的测定

运用Fenton反应原理，采用固定时间法，在510 nm 处测量含有被测物反应液的吸光度，与空白液进行比较，以测定被测物对羟自由基的清除作用^[13]。

表1 抗氧化试剂表

羟自由基清除率 (%)=A_o-(A_x -A _xo) /A_o·100%

其中A₀:空白对照组的吸光值  A_x:加样品的吸光值  A_x0:不加显色剂的吸光值

取3个15 ml小管，分别用标签纸写上A₀、A_X、A_X0,参照表1，依次向管中加入硫酸亚铁溶液，乙醇水杨酸溶液，两种样品粗提液，去离子水，过氧化氢溶液。将三个小管放入水浴锅中进行水浴加热，15分钟后取出，在波长为510 nm下用分光光度计测定吸光度，记录数据，计算羟自由基清除率^[1]，每组试验重复3次，计算平均值。

2  结果与分析

2.1  猪肝和羊肝对蛋白质聚沉的影响

羊肝粗提液对蛋白质聚沉的影响效果如图1所示。通过对24小时内加入trypsin的两种样品粗提液与加入磷酸缓冲液的两种样品粗提液的吸光度的测定，记录数据，分析数据可知，培养8小时后，蛋白吸光度开始增加，开始发生聚沉^[9]，此时处于上升期，培养20小时，吸光度不变，聚沉完全，进入平稳期。与对照组相比，羊肝的粗提液对于胰蛋白酶的聚沉有较为良好的抑制作用。在8小时之内，胰蛋白酶初步开始聚沉，羊肝粗提液对胰蛋白聚沉的影响效果，与对照组相比并不明显，随着时间的推进，羊肝粗提液对胰蛋白酶聚沉的抑制效果开始相对明显。整体分析，通过实验可以表明，羊肝的粗提液对于胰蛋白酶的聚沉有较为良好的抑制作用，抑制率为82.56%。

猪肝粗提液对蛋白质聚沉的影响效果如图1所示。通过对其测定吸光度，整理数据分析可得，猪肝的粗提液对于胰蛋白酶聚沉并没有较好的抑制作用^[10]。在8小时之内，与对照组相比，猪肝粗提液对于胰蛋白酶的聚沉有一定的抑制作用，时间较长时，猪肝粗提液对胰蛋白酶的聚沉不具有抑制作用。

图1 猪肝和羊肝对trypsin的聚沉动力曲线

2.2  猪肝和羊肝的抗氧化性作用

图2 两种样品粗提液的抗氧化率

注：图中的每组数据为3次试验的平均值，每组试验3次重复

猪肝和羊肝粗提液的抗氧化活性如图2所示，羊肝与猪肝的粗提液都有抗氧化性^[13]。羊肝粗提液的三组试验抗氧化率为96.15%、84.10%、88.28%，取平均值89.49%，3次平行重复试验的标准差为4.99%，表明重复性相对稳定，羊肝的粗提液具有抗氧化性^[15]。猪肝粗提液的3组平行试验的抗氧化率分别为88.37%、93.47%、80.00%，取平均值87.28%，3次平行重复试验的标准差为5.57%，可以看出重复相对稳定，猪肝粗提液具有抗氧化性。对材料进行10倍稀释，测得羊肝粗提液抗氧化率为63.0%，猪肝粗提液抗氧化率为62.8%。

2.3  猪肝和羊肝成分分析

对两种样品粗提液进行蛋白质聚沉及抗氧化分析可知，两种样品粗提液具有相似的抗氧化能力，但羊肝粗提液具有较好的抑制蛋白质聚沉的作用。因此，对两种材料的营养成分进行分析 ，如表2所示，两种材料中所含能量、碳水化合物、维生素A等具有较大差异，羊肝中维生素A含量远远高于猪肝，是猪肝的4倍左右，其他营养素成分含量相似。《黄帝内经》记载，“瞳子黑眼法于阴，白睛赤脉法于阳，阴阳合转而睛明。^[16]”维生素较早的运用到了眼疾中。中医记载，羊肝可医翳障^[2]，即视物不清，常说的白内障疾病。由此我们可以初步判断是羊肝中维生素A含量高于猪肝而导致羊肝粗提液有较为更好的抑制蛋白质聚沉的作用。

表2 两种样品100g可食部部分营养素含量

3  结论与展望

本研究选用羊肝与猪肝两种材料，用磷酸缓冲溶液进行水提，运用沉淀法利用96孔微量平板对两种材料抑制蛋白质聚沉作用进行分析，结果显示，羊肝粗提液对trypsin的聚沉有较为良好的抑制作用，而猪肝粗提液则没有良好的抑制效果。同时用水杨酸法对两种材料的抗氧活性进行了测定，两种材料都具有良好的抗氧化性，羊肝粗提液在10倍稀释的条件下，具有63.0%的抗氧化率。羊肝粗提液对trypsin有较为良好的抑制作用，由此我们可以推断羊肝对于白内障等由于蛋白质聚沉而引起的疾病也有一定的抑制作用，我们可以适量服用羊肝来达到对疾病的预防，而羊肝的加工方式与工艺及其作用机制仍待我们进一步研究。

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