鸭源乳酸菌复合制剂对樱桃谷鸭育雏期生长性能、免疫器官发育及肠道菌群的影响

涂健，全锁配， 蒋雯，袁林， 顾彬涛，宋祥军，祁克宗

(1.安徽农业大学动物科学学院，合肥 230036；2.安徽农业大学茶与食品科技学院， 合肥 230036；3.安徽农业大学生命科学学院， 合肥 230036；4.兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室， 合肥 230036）

摘  要：（目的）本试验旨在研究乳酸菌复合制剂对樱桃谷鸭育雏期生长性能、免疫器官发育和肠道菌群的影响。（方法）试验选择160只1日龄的樱桃谷鸭，随机分为两组，均饲喂基础饲粮，试验组灌喂1.5x10⁸ CFU/ml的乳酸菌复合制剂1ml，对照组灌喂等量PBS缓冲液。试验期14 d，记录每日饲粮消耗量，14 d时称重，计算平均日增重。采集胸腺、脾脏、法氏囊，测定免疫器官指数。采集盲肠肠道内容物，用于16S rDNA测序。（结果）试验结果表明：1)与对照组相比，乳酸菌组平均日增重提高了6.93%（P>0.05），日采食量增加了6.42%（P>0.05），料重比降低了0.89%（P>0.05）。2)试验组胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数均有增加，脾脏、法氏囊增重差异显著（P<0.05）。3)试验组盲肠微生物多样性丰富度高于对照组，拟杆菌门和厚壁菌门、软壁菌门等优势菌门丰度也高于对照组。（结论）由此可见，灌喂乳酸菌复合制剂可以促进樱桃谷鸭雏鸭生长、促进免疫器官发育，丰富肠道微生物的组成和多样性。

关键词：乳酸菌复合制剂； 生长性能； 免疫器官发育； 肠道菌群

（研究的重要意义）畜禽养殖业中抗生素不合理使用，导致药物残留、细菌耐药性等问题愈发严峻。寻新型饲料添加剂和抗生素替代品是近期关注热点之一。微生态制剂是由活体微生物制成的新式生物活性制剂^[1-2]。乳酸菌是益生菌的一种，有研究发现乳酸菌有提高动物生长性能，调节肠道菌群，保护肠道屏障，调节免疫系统等作用^[3-5]。一般初生雏鸭肠道为无菌状态， 3~7 日肠道主要菌群形成，7~16日消化道正常菌群基本形成。因此，使乳酸菌能够尽早地成为禽类肠道内的优势菌群，对避免禽类感染致病菌和提高生长性能、免疫机能有着积极作用^[6]。（前人的研究进展）Xiaofen, L等^[7]研究发现饲粮中添加乳酸杆菌、纳豆芽孢杆菌可以提高樱桃谷鸭生长性能，降低血液中谷丙转氨酶、碱性磷酸酶活性。喻婷等^[8]等发现饲粮中添加微生态制剂可以提高樱桃谷鸭生长性能、屠宰性状。（本研究的切入点）本实验室前期从鸭源分离到两株唾液乳杆菌菌株，抗逆性、抑菌效果及粘附性能良好，将其与干酪乳杆菌复配制成复合乳酸菌制剂。（拟解决的关键问题）旨在研究乳酸菌复合制剂对樱桃谷鸭育雏期生长性能、免疫器官发育和肠道菌群的影响，为乳酸菌复合制剂在樱桃谷鸭育雏期养殖的应用上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验采用单因素随机试验设计，选取1日龄樱桃谷鸭160只（公母各半），随机分为2组，对照组和试验组。每组4个重复，每个重复20只。各组试验雏鸭初始体重无显著差异（P>0.05），对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮的基础上每日灌喂1ml乳酸菌复合制剂（1.5x10⁸CFU/ml），灌喂使用1ml灌喂针，缓慢将1ml乳酸菌复合制剂液体灌喂至消化道中，灌喂前禁食2h，灌喂后禁食2h。对照组灌喂等量PBS缓冲液。试验周期14 d。所有试验雏鸭统一管理，相同饲养环境，自由采食，充足饮水。

1.2 试验材料

乳酸菌复合制剂（活菌数1.5x10⁸ CFU/ml），由兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室制备，由前期预试验灌喂樱桃谷鸭雏鸭不同梯度的乳酸菌复合制剂，14d经肠道回肠盲肠ERIC-PCR检验肠道菌群多样性确定了最佳饲喂浓度为1.5x10⁸ CFU/ml，最佳饲喂剂量为1mL。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生长性能

在试验开始第1天和第14天结束时分别空腹称重，记录每天饲粮消耗量。计算平均日增重（ADG,g/d）、平均日采食量（ADFI，g/d）和料重比（F/G）。

1.3.2 免疫器官发育

试验雏鸭解剖后，取胸腺、脾脏、法氏囊称重，计算胸腺指数、脾脏指数、法氏囊指数。

胸腺指数（%）=（胸腺重/宰前活重）x100

脾脏指数（%）=（脾脏重/宰前活重）x100

法氏囊指数（%）=（法氏囊重/宰前活重）x100

1.3.3 肠道内容物采集及总DNA提取

解剖雏鸭取盲肠，两头用灭菌细绳结扎，置于无菌管中，保存于-80°C备用。用天根粪便DNA提取试剂盒提取肠道内容物中细菌基因组总DNA，操作步骤按说明书进行。

1.3.4 16D rDNA测序

16S rDNA基因扩增及测序：用提取的樱桃谷鸭盲肠内容物粪便总DNA为模版，PCR扩增细菌16S rDNA的V3-V4区。采用通用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。扩增体系总量20 μl：5×FastPfu Buffer 4 µl，2.5 mM dNTPs 2 µl，Forward Primer(5 µM) 0.8 µl，Reverse Primer(5 µM) 0.8 µl，FastPfu Polymerase 0.4 µl，BSA 0.2 µl，模版DNA 10 ng，加入ddH2O补充至20μl。反应条件为：95°C预变性3min，95°C 30s、55°C 30s、72°C 45s 30个循环，72°C终延伸10min。后用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）切胶回收PCR产物，Tris-HCL洗脱；2%琼脂糖凝胶电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluor™ -ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。在Illumina Miseq平台上进行PE250测序。

1.3.4 数据统计分析

实验数据用Microsoft Office 2007中Excel处理，后用SPSS 17.0中独立样本t检验，结果用平均值±标准差表示，用Duncan氏法进行显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 复合乳酸菌制剂对樱桃谷鸭育雏期生长性能的影响

育雏期灌喂乳酸菌复合制剂，试验组的平均日增重与对照组相比提高了6.93%，平均日采食量提高了6.42%，料重比降低了0.89%。说明乳酸菌复合制剂对生长性能有提高趋势，但差异不显著（P>0.05）。详见表1。

表1 乳酸菌复合制剂对樱桃谷鸭雏鸭育雏期生长性能的影响

Table 1 Effect of compound lactobacillus preparation on growth performance of Cherry Valley Duck

2.2 乳酸菌复合制剂对免疫器官发育的影响

试验组脾脏、胸腺、法氏囊重量分别较对照组提高了28.24%、12.20%、2.47%，脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数分别较对照组提高了33.33%、12.50%和6.67%。试验组脾脏重量和法氏囊重量与对照组重量差异显著（P<0.05）。上述结果表明乳酸菌复合制剂可促进胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官发育。详见表2。

表2 乳酸菌复合制剂对免疫器官发育的影响

Table 2 Effect of compound lactobacillus preparation on growth performance of Cherry Valley Duck on immune organ development

2.3 乳酸菌复合制剂对樱桃谷鸭肠道菌群的影响

2.3.1 测序质量评价

对照组、试验组各取新鲜盲肠肠道内容物3个样品。测序后得到669681条序列，其中有效长度为290925213 bp。对照组平均长度为476.67 bp，试验组平均长度为471 bp。盲肠肠道菌群对照组OTU总数为330，试验组OTU总数为348，对照组独有的OTU数为21，试验组独有的OTU数为39。试验组肠道菌群生物多样性高于对照组。对应的稀释曲线趋于平缓，均达到平台期。详见图1、图2。

图1盲肠肠道菌群Shannon曲线

Fig.1 Shannon curve of intestinal microflora in the cecum

注：D代表对照组，R代表试验组，下图同

D stands for control group, R stands for test group, the same figure below

图2 盲肠肠道菌群物种组成OTU维恩图

Fig.2 The OTU Venn diagram of cecum Intestinal microflora species composition

2.3.2 盲肠肠道菌群多样性分析

樱桃谷鸭盲肠肠道微生物多样性对照组Sobs261.67低于试验组272.33。试验组Chao1指数3.75高于对照组3.49，ACE指数0.05低于对照组0.07。试验组Shannon指数和Simpson指数分别为292.50和294.10均高于对照组的282.96和285.78。Coverage指数均为1.0。饲喂乳酸菌复合制剂提高了樱桃谷鸭盲肠肠道菌群的多样性和物种丰富度。详见表3。

表3 盲肠菌群多样性指数

Table 2 The microflora diversity indexes of Cecum

2.3.2 樱桃谷鸭盲肠肠道菌群组成分析

盲肠肠道菌群物种组成，试验组盲肠肠道菌群丰富度高于对照组，门水平上，试验组的优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、软壁菌门、变形菌门，分别占比70.40%、27.53%、0.80%、0.70%、0.44%。对照组优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门、变形菌门，分别占比65.69%、33.66%、0.18%、0.28%。属水平上，试验组瘤胃球菌属扭链胃球菌群（Ruminococcus_torques_group）、未分类的毛螺菌科（unclassified_f_Lchnospiraceae）、拟杆菌科（Bacteroides）、副杆状菌属（Parabacteroides）丰度低于对照组；肠球菌属（Enterococcus）、布劳特氏菌属（Blautia）、丁酸梭菌属（Butyricicoccus）、未排名的瘤胃球菌科（norank_f_Ruminococcaceae）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、未排名的韦荣球菌科（norank_f_Erysipelotrichaceae）等丰度均高于对照组。详见图3、图4、图5。

Fimicutes：厚壁菌门； Bacteroidetes：拟杆菌门； Actinobacteria：放线菌门； Tenericutes：软壁菌门； Proteobacteria：变形菌门； Verrucomicrobia：疣微菌门。

图3 盲肠肠道菌群门水平物种组成分析

Fig.3 Cecum Intestinal microflora composition at phylum level

Fimicutes：厚壁菌门； Bacteroidetes：拟杆菌门； Actinobacteria：放线菌门； Tenericutes：软壁菌门； Proteobacteria：变形菌门； Verrucomicrobia：疣微菌门。

图4 盲肠肠道菌群门水平群落热图

Fig.4 Heatmap of cecum Intestinal microflora at phylum level

Anaerofilum 细杆菌属； Anaerostipes毛螺旋菌科； Subdoligranulum罕见小球菌属； Eubacterium_coprostanoligene_group真杆菌属产粪甾醇群； Ruminococcaceae UCG-014瘤胃球菌科UCG-014； unclassified_f_Ruminococcaceae 未分类的瘤胃球菌科； norank_f_Erysipelotrichaceae 未排名韦荣球菌科； Anaerotruncus 厌氧干菌属； Enterococcus 肠球菌属；Butyricicoccus 丁酸梭菌属； Faecalibacterium 粪杆菌属； norank_f_Ruminococcaceae 未排名的瘤胃球菌科；Blautia布劳特氏菌属； Ruminococcus_torques_group瘤胃球菌属扭链胃球菌群；unclassified_f_Lachnospiraceae 未分类的毛螺菌科 ； Bacteroides 拟杆菌科；Parabacteroides副杆状菌属；Others 其他；

图5 盲肠肠道菌群属水平物种组成分析

Fig.5 Cecum Intestinal microflora composition at genus level

3 讨  论

3.1 乳酸菌复合制剂对樱桃谷鸭育雏期生长性能的影响

乳酸菌能够提高食物消化率，促进排泄，抑制肠道腐败作用，从而促进生长^[9]。然而在乳酸菌对樱桃谷鸭增重上的研究结果不尽相同，孙玉章等^[10]研究发现复合乳酸菌制剂能够改善肉鸡生长性能，显著降低料重比，提高日增重。Bai等^[11]研究发现饲喂益生菌饲料的肉仔鸡平均日增重ADG和饲料转化效率在不同生长阶段作用存在差异。Wang H等^[12]研究发现益生菌能够分泌多种消化酶、提高饲粮消化率，促进肉鸡生长，抑制肠道内有害菌的繁殖，来改善肠道内微生态平衡，但发挥作用较为缓慢。本试验结果表明，灌喂乳酸菌复合制剂对末体重、平均日增重ADG和平均日采食量ADFI和料重比均有一定程度的改善，但试验组对照组差异不显著（P>0.05）。说明益生菌的使用有提高生长性能的趋势，可能随着试验周期的延长，作用效果会更明显。考虑后续实验将增加饲喂的周期。

3.2乳酸菌复合制剂对樱桃谷鸭育雏期免疫器官发育的影响

免疫器官发育的差异可能与动物机体的健康状况有关。微生态制剂中有益菌的菌体成份，如胞壁糖、多肽、肽聚糖、蛋白以佐剂的形式刺激免疫器官，促进免疫器官生长发育，其次益生菌在肠道内大量生长繁殖时，合成氨基酸、有机酸、维生素等营养物质也可促进免疫器官的生长发育^[13]。益生菌能够产生细菌素，还能通过激活抗菌分子的分泌刺激宿主肠道免疫系统（AMS）、分泌防御素抑制肠道内的有害微生物繁殖^[14]。赵娜等^[15]研究认为雏鸡法氏囊萎缩则不能产生抗体，如果法氏囊发达，则有利于抗体产生。

Guo等^[16]发现饲喂微生态制剂的樱桃谷鸭免疫器官指数较对照组更高（P＜0.05）。本试验研究发现，乳酸菌复合制剂对樱桃谷鸭育雏期的雏鸭免疫器官发育有一定的促进作用，脾脏、胸腺、法氏囊重量分别较对照组提高了28.24%、12.20%、2.47%，脾脏指数、胸腺指数、法氏囊指数分别较对照组提高了33.33%、12.50%和6.67%。试验组脾脏、法氏囊指数较对照组有显著差异（P<0.05）。此结果与报道的乳酸菌对胸腺、脾脏、法氏囊等免疫器官指数有促进生长的作用的结果相一致。

3.3乳酸菌复合制剂对樱桃谷鸭育雏期肠道菌群的影响

禽类盲肠是混合消化物发酵并吸收的重要场所，影响禽类健康和生产性能^[17]。乳酸菌复合制剂能促进肠道正常微生物区系的建立，通过黏着位点竞争作用、发酵产酸降低肠道内环境pH值等手段，抑制有害菌、病原菌生长，从而维持正常的肠道菌群^[18]。肠道微生物群是一个与宿主有共生关系的复杂生态系统。 肠道微生物群落组成的改变改变了特定代谢途径，会改变宿主代谢^[19]。

16S rDNA测序可以用于检测菌群多样性和种群丰度^[20]。 Xing等^[21]研究发现饲粮中添加微生态复合制剂比金霉素组和对照组可以显著提高盲肠中乳杆菌计数（P<0.05）。Jumpertz等^[22]研究发现厚壁菌门和拟杆菌门与宿主代谢相关。粪便中的厚壁菌门数量增加，营养吸收增强，而拟杆菌门数量的增加则会减少了营养吸收。

本试验通过盲肠肠道内容物16S rDNA测序得到，试验组饲喂乳酸菌复合制剂的OTU数要高于对照组。

微生物群落组成分析中，试验组优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、软壁菌门、变形菌门，分别占比70.40%、27.53%、0.80%、0.70%、0.44%。对照组优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门、变形菌门，分别占比65.69%、33.66%、0.18%、0.28%。试验组厚壁菌门、软壁菌门、变形菌门、放线菌门等优势菌门相对丰度高于对照组，拟杆菌门丰度低于对照组。推测因为饲喂乳酸菌复合制剂改变了肠道菌群组成。说明乳酸菌复合制剂有助于增加营养吸收，提高樱桃谷鸭代谢。

属水平上，试验组瘤胃球菌属扭链胃球菌群（Ruminococcus_torques_group）、未分类的毛螺菌科（unclassified_f_Lchnospiraceae）、拟杆菌科（Bacteroides）、副杆状菌属（Parabacteroides）丰度低于对照组；肠球菌属（Enterococcus）、布劳特氏菌属（Blautia）、丁酸梭菌属（Butyricicoccus）、未排名的瘤胃球菌科（norank_f_Ruminococcaceae）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、未排名的韦荣球菌科（norank_f_Erysipelotrichaceae）等丰度均高于对照组。谢丽静等^[23]研究发现丁酸梭菌能够促进短链脂肪酸产生，是肠道上皮细胞的主要的营养物质，有助于降低肠道内环境pH值，对肠道上皮细胞具有修复和再生的作用。丁酸梭菌还能产生各种消化酶类，提高饲粮消化率，从而促进生长。试验组中布劳特氏菌属（Blautia）、未排名的瘤胃球菌科（norank_f_Ruminococcaceae）、未排名的韦荣球菌科（norank_f_Erysipelotrichaceae）、Faecalibacterium等与代谢相关的微生物丰度均高于对照组。说明乳酸菌复合制剂能够促进樱桃谷鸭育雏期快速建立肠道微生物区系，丰富肠道群落。

4 结  论

樱桃谷鸭育雏期添加乳酸菌复合制剂能够提高平均日增重、降低料肉比，在一定程度上对雏鸭的生长性能有促进作用。乳酸菌复合制剂能够促进免疫器官发育，改善肠道菌群，增加肠道微生物物种多样性和丰富度。

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