PHC1基因敲降对小鼠胚胎干细胞多能干性的影响

文欢， 曾建平*

（南华大学附属湘潭市中心医院，湖南 衡阳 421001）

摘要：多梳家族蛋白（polycomb group protein , PcG）能直接作用于大量的调节细胞命运相关基因，使细胞进入分化状态，而多梳家族蛋白PHC1基因对小鼠胚胎干细胞（Mouse embryonic stem cell，mESC）的多能干性的影响尚不清楚。本文通过构建PHC1敲降细胞系，探讨PHC1基因敲降对mESC多能干性的影响及其可能的分子机制。成功构建和鉴定PHC1敲降细胞系后，通过qRT-PCR、Western-Blot、免疫荧光染色法检测mESC表面多能干性标志物的表达量，其结果显示实验组（shPHC1组）较阴性对照组（Empty vector）和空白对照组（control）相比，干性基因nanog、oct4、sox2的表达下调，mESC细胞形态呈现分化状态。实验表明，敲降PHC1基因可能通过抑制核心转录调控“铁三角”( nanog、oct4、sox2 ）之间的相互转录调控机制，导致多能干性基因沉默，从而影响mESC多能干性的维持。

关键词：PHC1基因；小鼠胚胎干细胞；多能干性；表观遗传学。

基金项目：湖南省卫生厅科研项目（2014FJ6005、B2015-162）

The effect of PHC1 gene knockdown on pluripotency of mouse embryonic stem cells

WEN Huan，ZENG  Jianping

( Xiangtan Central Hospital affiliated to University of South China , Hengyang 421001，Hunan , China )

Abstract：Polycomb group protein (PcG) can directly act on a large number of regulating cell fate-related genes to cells, allowing cells to enter a differentiated state, while the effect of PHC1 gene on pluripotency of mouse embryonic stem cells (mESC) is uncertain. This study we established the PHC1 knockdown cell lines to investigate the effect of PHC1 knockdown on the pluripotency of mESC and discuss its potential molecular mechanisms. After successfully constructing and identifying the PHC1 knockdown cell lines, the expression levels of mESC specific markers were detected by qRT-PCR, Western-Blot and immunofluorescence staining. The results showed that the experimental group (shPHC1 group) was lower than the negative group (Empty vector) and blank control group(control group), the expression of the pluripotency genes nanog, oct4,and sox2 was down-regulated, and the morphology of mESC cells was differentiated. Our data suggested that knockdown of the PHC1 gene may affect the maintenance on pluripotency of mESC by inhibiting the core transcriptional regulator "iron triangle" (nanog, oct4, sox2) on its mechanism of transcription and regulation to silence the pluripotency gene.

Key words  PHC1 gene; Mouse embryonic stem cell ;  pluripotency;  epigenetics

多梳家族蛋白（PcG蛋白）首先发现于抑制性调节果蝇生长发育Hox基因家族的转录，并且在进化过程中高度保守，从而维持同源异形基因稳定表现及细胞命运的重要表观遗传分子^[1]。主要由两个蛋白聚合物PRC1和PRC2组成，PRC1的成份比较复杂，根据聚合物中是否存在CBX蛋白，分为经典PRC1(cPRC1)和非经典(ncPRC1)两类，经典的PRC1由CBX、PCGF、PHC和RING组成，非经典的PRC1根据蛋白的不同可分为RYBP-PRC1、KDM2B-PRC1和E2F6-PRC1聚合物，其中CBX蛋白结合PRC2催化产生的组蛋白H2A上第27位赖氨酸发生甲基化修饰（H3K27Me3）后招募cPRC1到PRC2的靶基因上, RING1A/B催化组蛋白H2A上第119位赖氨酸发生单个泛素化修饰(H2AK119Ub1), 从而使染色质结构发生固缩导致靶基因沉默。ncPRC1不包含CBX和PHC蛋白，由RYBP分别和PCGF1，PCGF3/5, 或PCGF6结合组成。ncPRC1含有具有识别特异性DNA序列的结合蛋白, 能够不依赖于PRC2直接使得靶基因产生H2AK119Ub1，导致靶基因沉默^[2]。其功能涉及转录调节，胚胎和成体干细胞维持以及癌症等发展的表观遗传染色质修饰^[3]。这些蛋白各自还有很多的直系同源物，而PHC包括PHC1、PHC2、PHC3，PHC1蛋白(也称rae28)是哺乳动物和果蝇PcG蛋白家族PRC1复合物的重要一员，蛋白结构本身含有SAM(sterile alpha motif)结构域和锌指(zinc finger)结构域。其中SAM结构域介导PHC1与其它蛋白的相互作用使其发生寡聚化，而锌指结构域能够和核酸结合，两者对于cPRC1介导的基因沉默都发挥重要作用^{[4, 5]}。

表观遗传学是研究基因核苷酸序列不发生变化的情况下产生可遗传基因表达改变的学科。表观遗传学机制包括DNA甲基化、基因沉默、组蛋白修饰、基因组印记、染色体失活等。有研究表明干细胞体内发育和体外分化伴随着由表观遗传机制介导的mESC多能干性基因的逐渐关闭以及分化相关基因逐渐开启过程^{[6, 7]}，因此表观遗传机制在干细胞命运决定中起着重要作用。

前期研究表明，不管是在人还是小鼠的胚胎干细胞中，PcG家族蛋白能直接作用于大量的调节细胞命运相关基因，激活基因转录，使细胞进入分化状态^{[8, 9]}。在小鼠ESCs中，Phc1被认为通过结合分化发育相关基因抑制其转录参与多能性的维持 ，故PHC1可不完全通过cPRC1介导的表观遗传学机制介导靶基因的沉默参与多能干性的维持^[2]。因此，本文拟通过慢病毒介导沉默小鼠胚胎干细胞（mESC）PHC1基因的表达，初步探讨沉默PHC1基因沉默对mESC的多能干性的影响及其可能的机制。

1.材料与方法

1.1：材料 Empty vector 为PLKO克隆载体，购自addgene，sh-RNA PHC1敲降质粒由本课题组成员前期构建完成，并保存于-80℃冰箱。胎牛血清FBS购自Gibco，高糖购自Corning，0.1% geltin明胶、PHC1、nanog、oct4、sox2抗体均购自Abcam，actin抗体、RIPA裂解液购自碧云天。转染试剂盒购自百恩维生物，shRNA序列合成及测序为擎科生物，ECL显色液购自Thermo，Brilliant SYBR Green Q-PCR Master Mix购自Takara。

1.2 PHC1-shRNA细胞系和Empty vector (PLKO空载质粒)细胞系构建。

将PHC1-shRNA和PLKO空载质粒分别与PSPAX，PMD共转染293T细胞，48h后收病毒，浓缩、离心并感染mESC细胞，经puro筛选后得到稳定的PHC1敲降mESC细胞系。

1.3：Western-Blot检测PHC1蛋白的表达情况

将待测细胞消化离心收集，预冷的PBS清洗3遍，加入RIPA和蛋白酶抑制剂使细胞裂解，超声破碎后离心收集蛋白，BCA法蛋白定量，10%浓度的SDS-PAGE凝胶分离蛋白，将分离的蛋白转至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭1小时，加入待测一抗， 4℃摇床过夜孵育，PBST洗膜3次，10min/次，二抗室温孵育1小时，洗膜同前。ECL显影检测蛋白表达量。

1.3：细胞培养

37℃水浴锅内复苏小鼠胚胎干细胞，随后加入适量完全培养基离心、重悬并轻轻吹打，转移至提前0.1% geltin明胶包被培养皿中，37℃、5%CO₂饱和

浓度与成份配比，50ml为例：FBS 7.5ml、Glutamax 500μl、P/S 500μl、NEAA 500μl、β-巯基乙醇 3.5μl、LIF 5μl、高糖H-DMEM补足50ml。

1.5：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测相关基因的表达

待测细胞均采用Trizol提取RNA，参照反转录试剂盒RT-PCR逆转录为cDNA , 然后根据Brilliant SYBR Green Q-PCR Master Mix试剂说明书程序进行qRT-PCR测定基因表达。qRT-PCR反应体系：10μl  cDNA 0.3μl、SYBR 5μl、F 0.2μl、R 0.2μl、ddH2O 4.3μl。本文中所用的qRT-PCR引物如下列举：

PHC1:

F:5’-GAGTCAGACAGAGCACCAGC-3’,

R:5’-CTGCACTGCTTGTCGTTCAT-3’;　　

Actin:

F:5’-GTGTGACGACGAGGAGAC-3’,

R:5’-CGATGGACGGGAAGACAG-3’;

nanog:

F:5’-TGAGCTATAAGCAGGTTAAGAC-3’,

R:5’-CAATGGATGCTGGGATACTC-3’;

oct4:

F:5’-CACGAGTGGAAAGCAACTCAG-3’,

R:5’-CTGGGAAAGGTGTCCCTATAG-3’;

sox2:

F:5’-CGAGATAAACATGGCAATCAAATG-3’,R:5’-AACGTTTGCCTTAAACAAGACCAC-3

1.6：免疫荧光染色

PHC1、nanog、sox2、oct4、DAPI免疫荧光染色，具体步骤为：弃培养基，PBS漂洗3遍，4%的多聚甲醛固定样本，避光15分钟，PBS漂洗3遍，加入封闭液0.5ml/孔，封闭30分钟后弃去，4℃避光过夜孵育一抗，PBST洗3次，5min/次，孵育二抗，室温避光约2小时后吸走二抗，PBST洗3次，5min/次，DAPI核染，12孔板0.5ml每孔，10min后吸走再用PBST洗2遍，封片，激光共聚焦显微镜观察、拍照并保存。

1.7：统计学分析

采用GraphPad  Prism6进行统计学　分析，所有实验数据以`x ± s，每组实验均重复3次，组间两两比较采用t检验，p＜0.05表示差异有统计学意义。

2. 结果：

2.1. 慢病毒介导的PHC1敲降细胞系的鉴定

shRNA-PHC1（图1 ）病毒感染mESC，1周后在电子显微镜下观察到的mESC大体细胞形态，可见对照组mESC呈圆形，核大质少，边界清楚（图2A、2B），而实验组mESC细胞边缘变的锐利，形态变的不规则，细胞出现明显的分化现象（图2C）。qRT-PCR (图3)、Western- Blot (图4)结果显示PHC1在mESC的RNA和蛋白水平表达均明显下调(P<0.05)，提示shRNA沉默效果理想。

 图1 shRNA寡核苷酸序列，用于沉默PHC1蛋白

2.2：敲降PHC1基因后的多能干性标志性基因的免疫荧光染色分析

敲降PHC1蛋白后，PHC1与nanog 、sox2、oct4的免疫荧光染色分析（图5、图6、图7），提示PHC1基因敲降的mESC，同时可下调nanog、sox2、oct4蛋白的表达（图5、图6、图7白色箭头所指），nanog、sox2、oct4可见明显的下调共定位现象，对shRNA组中（每批计数200个mESC，重复三次）出现下调共定位的进行统计分析（图8），可见nanog蛋白约60%，sox2蛋白约32%、oct4蛋白约26%出现下调共定位现象。而qPCR检测多能干性标志性基因nanog、sox2、oct4与control、Empty vector相比，下调明显（图8）。提示敲降PHC1基因后，mESC出现明显分化，其机制可能实影响了核心转录因子nanog、sox2和oct4之间的相互调控网络。