Mircorna 在奶牛乳腺炎发生发展过程中的作用研究进展

吕亚南,赵俭，姚竟杰，安志兴^*

（河南科技学院动物科技学院，新乡，453003）

摘要：MicroRNA (miRNA)是小的内源性非编码RNA，有研究表明，miRNA对乳腺发育过程有影响，其参与多种病理生理过程。miRNA广泛的参与生物过程，包括细胞生长，分化，增殖，凋亡，代谢和免疫反应等，在免疫调节中对乳腺炎的发生发展过程有重要的调节作用。本文综述了基于高通量测序研究奶牛乳腺炎miRNA差异表达，miRNA与乳腺炎发生发展研究以及miRNA参与研究路径。

关键词：miRNA;乳腺炎;研究进展

Research progress on Mircorna's role in the development of cow mastitis

Abstract: microRNA(miRNA) is a little endogenous non-coding RNA. Studies have shown that miRNA has an impact on breast development and participates in various pathophysiological processes. MiRNA is widely involved in biological processes, including cell growth, differentiation, proliferation, apoptosis, metabolism, and immune response. It is in an important regulatory effect on the occurrence and development of mastitis in immune regulation. In this paper, the differential expression of miRNA in dairy cows based on high-throughput sequencing, development of miRNA and mastitis and the pathway of participation of miRNA were reviewed.

Key words: miRNA; Mastitis; Research progress

奶牛乳腺炎是由物理、化学或生物学刺激乳腺后机体与环境、病原微生物相互作用而引起乳腺的炎症反应。大多数奶牛乳腺炎是由病原微生物黏附在乳腺组织上引起的,到目前为止，已经分离和鉴定了130多种致病微生物，其中90％是金黄色葡萄球菌，链球菌和大肠。尽管世界各国的学者为防治乳腺炎已经有100多年的不懈努力，但还没有提出一种能有效预防和治疗乳腺炎的方法。抗生素治疗一直是用于预防和治疗奶牛乳房炎的首选。 但随着抗生素的广泛使用和抗生素的过量使用，病原抗性甚至多药耐药性越来越普遍，逐渐成为制约奶牛乳腺炎防治的瓶颈。miRNA通过引起RNA降解或通过与mRNA内的互补序列碱基配对阻断翻译来在转录后水平调节基因表达。 由于miRNA的部分互补性足以靶向mRNA，因此每个miRNA都具有调节大量基因的能力。研究奶牛血液，奶样，正常和乳腺炎乳腺组织中miRNA表达情况以及调节标基因表达情况，对乳腺发育，泌乳及乳腺炎抗性相关基因表达调控具有重要作用。

一、基于高通量测序研究奶牛乳腺炎miRNA差异表达

1.miRNA在健康乳腺细胞和乳腺炎细胞中的差异性表达

miRNA是小的内源性非编码RNA，通过降解靶mRNA或抑制翻译来调节转录后的基因表达。 它们本质上是耐寒的，对RNAse降解，酸性pH和反复冻融都有抵抗力，并且在室温下稳定[1]。 成熟的miRNA整合到RNA诱导的沉默复合物（RISC）中，并通过部分序列互补将其导向靶mRNA。 miRNA通过翻译抑制（48％通过RISC复合物）或mRNA降解（29％）或两种现象（23％）下调目标基因表达[2]。与乳腺炎相关的免疫应答是一个非常复杂的生物过程，涉及免疫细胞，乳腺上皮细胞和内皮细胞。因此，从分子水平上了解乳腺组织乳腺炎的病理生理过程和宿主免疫反应，对于控制乳腺炎的新策略的发展非常重要[3]。

无乳链球菌是牛乳腺炎的常见和主要原因[4]。几项研究报道了细菌感染期间牛中多种差异表达的miRNA，表明这些miRNA在宿主免疫应答中的作用。以前的文献已经证实，一些疾病相关的miRNA在具有变异表达水平的各种疾病中发挥它们的生物调节功能。例如，在用大肠杆菌（E.coli）攻击的牛乳腺上皮细胞中上调了5种miRNA（miR-184，miR-24-3p，miR-148，miR-486和let-7a),而当用金黄色葡萄球菌攻击时，在相同细胞中上调其他四种miRNA（miR-2339，miR-499，miR-23a和miR-99b）[5]。此外，在用脂多糖和金黄色葡萄球菌肠毒素B刺激的牛单核细胞中，五种与炎症相关的miRNA（miR-9，miR-125b，miR-155，miR-146a和miR-223）上调[6]。这些体外细胞培养研究表明至少一些miRNA在感染反应中涉及牛乳腺免疫。

2.miRNA泌乳期和非泌乳期的差异表达

大量研究证实miRNA是乳腺发育与泌乳的重要调控因子,主要表现在调控乳导管和腺泡的正常发育及乳腺上皮细胞的增殖、分化和凋亡。Li等人鉴定了56种在牛泌乳期和非泌乳期间显着差异调节的miRNA[7]。共鉴定出56个miRNA，其中41个在两个时期均有表达，而非哺乳期只有6个高表达，哺乳期有9个[7]。 MiR-138在哺乳期表达最高，Stat5和Mapk是miR-138的已知靶点，其最终抑制催乳素受体（PRLR）并降低小鼠乳腺上皮细胞的增殖[7]。最近发现miR-152靶向DNMT1，从而抑制整体DNA甲基化并增强泌乳相关基因/途径，例如PI3K / AKT信号传导途径和PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）表达以及β-酪蛋白，甘油三酯的分泌和乳糖在乳牛乳房上皮细胞中的表达[8]。此外，已发现多个miR-29成员通过逆向靶向DNMT3A和3B来调节DNA甲基化水平，所述成员在泌乳相关基因如CSN1S1（酪蛋白α1），ELF5的启动子处其抑制引起全局DNA超甲基化的乳牛乳房上皮细胞中（E74样因子5），PPARγ，SREBP1（固醇调节元件结合蛋白1）和GLUT1（葡萄糖转运蛋白1）[9]。此外，发现miR-486通过下调PTEN并改变对乳腺功能至关重要的下游基因如AKT和MTOR的表达来调节牛乳腺上皮细胞中的磷酸肌醇信号传导[10]。 miR-486也刺激了乳腺上皮细胞的增殖以及分泌β-酪蛋白，乳糖和脂质的能力[10]。在奶山羊中进行的两项独立研究中使用了类似的方法，但是它们各自的最丰富和差异表达的miRNA明显不同[11][7]。Wang等人[12]评估了干奶期（产前30天），新鲜期（产后7天）和泌乳早期（产后30天）奶牛中13种miRNA的表达。与哺乳期相比，在干燥期中鉴定出的12种miRNA（miRNA-10a，15b，16,21,33b，145,146b，155,181a，205,221和223）下调。 miRNA- 31是个例外，与干期相比，在泌乳早期表现出更高的表达。

miRNA也被发现在猪泌乳中起关键作用。 在两个不同品种的母猪 - 金华和约克夏进行表达分析，在两个品种中miRNA的产量高度相关[13]。 miRNA靶基因分析筛选了涉及乳腺上皮增殖能力和上皮细胞活力的五种基因[13]。 此外，已经确定miRNA在大鼠泌乳中发挥重要作用，其中在产后第1天和第7天分别鉴定了395和400个miRNA[14]，其中27个miRNA在其之间差异表达 产后第1天和第7天[14]。这些部分中高度表达的miRNA的功能研究表明它们作为乳腺功能调节因子对健康牛奶产量的贡献。

3.miRNA奶牛乳腺不同发育时期的差异

    哺乳动物乳腺发育可分为胚胎期、幼年期、青春期、性成熟期、妊娠期、泌乳期和退化期几个阶段，随着哺乳动物的受精、妊娠、产仔、哺乳和断奶的过程，乳腺可重复经历妊娠期、泌乳期和退化期。Wang等[52]通过基因芯片和real-time PCR检测乳腺中从妊娠到哺乳期的miRNA表达，发现不同阶段乳腺发育的miRNA表达模式不同。其数据分析结果发现, miR-138、miR-413、miR-133、miR-133a和miR-133b 具有明显的阶段性表达特点, miR-138、miR-413 在青春期和退化期比妊娠期和泌乳期高,miR-133、miR-133a 和miR-133b 则呈现相反的表达模式。Avril-Sassen 等[51]利用基于微球的流式细胞表达图谱, 对小鼠出生后16 个时期的乳腺组织进行了miRNA(318 个)表达分析和相应时期的全基因组mRNA 表达分析, 结果发现在小鼠乳腺发育过程中1/3 的小鼠miRNA(102 个)得以表达, 并呈现为7 个时期性共表达簇, 这些共表达簇中的miRNA 在乳腺发育过程中具有相似的表达变化趋势。除此之外,总miRNA 和mRNA 的表达量在泌乳期和退化早期显著下降, miRNA 与靶基因mRNA 的负相关性只在部分miRNA 中发现。Sdassi 等[50]发现的33 个新的鼠miRNA 中, 有11 个仅在退化期表达。

二、miRNA与乳腺炎发生发展研究

1.miRNA与奶牛乳腺疾病调控

miRNA在维持细胞稳态中发挥重要作用。 miRNA表达异常与特定疾病有关[15]。研究乳腺组织中响应乳腺炎的miRNA的适应性变化可以阐明miRNA调节免疫应答的机制，并提供控制乳腺炎的适当策略。Junhua Pu等人鉴定了35个差异表达的miRNA，其中包括10个上调的miRNA和25个下调的miRNA，在牛乳腺组织中与无乳链球菌型乳腺炎相关[16]。其中，miR-223表现出最高水平的上调。在之前对牛乳腺炎的研究中，miR-223也上调2-5倍[16]。 miR-223在炎症中起关键作用;例如，miR-223负调控嗜中性粒细胞增殖和分化，并减少延伸因子E2F1表达以限制细胞周期过程[17,18]。 miR-223还通过靶向IGR1R来抑制几种信号传导途径[16]。包括GZMB，IKKa，RC3H1和STAT3在内的miR-223的有效靶点对炎症和感染有影响[19]。这表明miR-223的一些预测靶基因在无乳链球菌乳腺组织感染期间参与了免疫途径。因此，miR-223在未来的研究中可能有用作乳腺炎的候选生物标志物。与miR-223类似，miR-16也与免疫应答有关。之前有研究表明，miR-16a的一个重要功能是维持和调节细胞中炎性介质的水平[20]。在奶牛乳房链球菌攻击后，miR-16a上调了白细胞介素IL-6，IL-8和IL-10[16]。 miR-16也调节巨噬细胞极化，炎性体和NF-κB信号传导[21]。

以前的研究发现牛乳房组织中牛miR-146a的表达显着增加，这些组织来自由金黄色葡萄球菌，大肠杆菌或混合细菌感染引起的乳腺炎，并且支持牛miR-146a在bMECs 中调节炎性细胞因子如TNF-α，IL-6和IL-8的分泌。Zhuo-Ma Luoreng等[22]检测了感染金黄色葡萄球菌或大肠杆菌的牛乳腺中表达的miRNA，并鉴定了580种已知的miRNA和1258种新型miRNA。这些miRNA可能参与调节各种免疫信号通路，包括TLR信号通路，MAPK信号通路，细胞粘附分子，TGF-β信号通路，细胞因子 - 细胞因子受体相互作用，白细胞跨内皮迁移和趋化因子信号通路检测到的DIE-miRNA的靶基因的KEGG途径富集分析[22]。此外，许多DIE-miRNAs，如bta-miR-144，bta-miR-451和bta-miR-7863可能是这里研究的两种类型的乳腺炎的生物标志物[22]。

2.miRNA与奶牛乳腺炎抗性育种

随着高通量测序和基因芯片在基因分子标记和基因差异表达上的应用，奶牛乳腺炎抗性育种取得较大进展，目前已初步确定的乳腺炎抗性候选基因有热休克蛋白70基因（HSP70)，乳铁蛋白基因(Lf)，β-防御素基因，牛主要组织相容性复合物基因（BoLA），TOLL样受体基因(TLRs)，补体成分基因（C），研究证明这些基因与奶牛乳腺炎抗性都有相关性，而据swanson报道，与奶牛乳腺炎抗性相关的基因还有很多。

虽然大多数乳腺炎的发生可以通过品种，产次，管理和环境来解释[23-25] ，但有几份报告显示牛淋巴细胞抗原（BoLA）DRB3（主要组织相容性复合物）与对乳腺炎的抗性相关（[25-27]）;还观察到DRB3.2与产奶性状有关（[28，29]）。 Rupp等人最近的报告[27]显示DRB3.2与抗体介导的免疫应答，细胞介导的免疫应答和体细胞评分相关。最近对奶牛BoLA-DRB3.2的研究只涉及纯种（Bos taurus或Bos indicus）。 DRB3 * 1和DRB3 * 52等位基因与乳腺炎发生最相关，而DRB3 * 15，DRB * 22和DRB3 * 51是与乳腺炎抗性最相关的等位基因。M. Duangjinda等[30]证实DRB3 * 1和DRB3 * 52是易感等位基因，DRB3 * 51和DRB3 * 15是杂种荷斯坦奶牛的抗性等位基因。此外，乳腺炎易感相关等位基因倾向于增加产奶量，而抗乳腺炎相关等位基因倾向于降低产奶量。等位基因DRB3 * 10对提高产奶量具有最大影响，对临床乳腺炎具有中度耐药性，可作为乳制品遗传评估选择的潜在标志。

3.miRNA与炎症条件下奶牛乳腺发育和乳汁分泌

牛乳腺炎是一种炎症驱动的牛乳腺疾病，每年造成全球乳品行业数十亿美元的损失[31]。控制乳腺炎所做的努力包括研究在感染宿主后的宿主反应及适当控制策略的发展。在分子水平研究免疫反应的调节机制对于病原体感染后的乳腺炎的控制尤为重要。Taketoshi等从牛奶的超微小泡中获得许多与乳腺和免疫相关的microRNAs。李惠侠等[56]发现高温条件下抑制miR-24的表达，乳腺上皮细胞增殖能力显著增强，说明内源性miR-24对乳腺组织发育具有重要的调控作用，抑制miR-24的表达可以缓解高温诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡发生率，促进细胞的生长发育。

了解涉及乳腺炎的分子机制将有助于制定新的策略来预防和治疗这种疾病。两项最近的研究检测了乳房链球菌诱导的乳腺炎中的miRNA表达模式：一种侧重于感染后12小时的体内感染和miRNA表达，而另一种检查在培养的乳房上皮细胞中不同时间的表达模式。这两项研究都提供了感染后引发的快速多样反应的有趣见解。

在第一项研究中，Naeem等人[32]在用乳房链球菌攻击后12小时检查了乳腺中14种miRNA的表达模式。所得数据加上2,102个基因的微阵列基因表达模式用于生物信息学分析以鉴定miRNA靶标和涉及的生物途径。结果显示与健康对照动物相比，miR-15b，16a，31,145和181a的miRNA的下调和乳腺炎中的miR-223的上调。确定的靶基因主要与免疫调节，代谢过程和细胞增殖/分化有关。 miR-16a表达的变化与一些白细胞介素（IL-6，IL-8和IL-10）的上调有关。miR-16a可能控制牛乳腺中关键炎症成分的水平，并可能在调节对乳腺炎的反应中起作用。乳腺炎导致miR-181a的下调，其在免疫系统中发挥作用（例如Toll样受体和B细胞受体信号传导的增加）。然而，miR-181a的减少与急性炎症反应小鼠观察到的减少相反[33]。在后一种情况下，诱导炎症后2小时内miR-181a的水平增加并且在治疗后长达6小时保持高水平;然而，12小时后表达低于对照动物。这两项研究之间的差异可能与Naeem等人的取样间隔有关。 唯一在乳房乳腺炎中上调的miRNA是miR-223，其可以通过抑制下调IGF1R（胰岛素生长因子1受体）介导的几种细胞信号传导途径。

在第二项研究中，Lawless等人[34]确定了15种miRNA，它们在用乳房链球菌激发的培养的牛乳房上皮细胞中表现出改变的表达。接种后第一个小时未观察到变化，但在2小时后，miRNA 29e和miRNA708上调。随后在攻击后4小时上调miRNA7b和miRNA98。在6小时，12种miRNA被上调（miRNA 7b，7d，7e，24-2,128-1,128-2,185,200c，210,494,652和2342）。下调首先在4小时才被观察到并涉及miRNA29b-2,193a和130a。两个miRNA（29b-2和130a）在4小时和6小时下调。尽管鉴定出大量5'异构体，但它们以低速率表达。目标基因的预测表明，只有在接种后4小时和6小时下调的miRNA显着富集了在先天免疫中有作用的基因。

三、miRNA研究路径

1.miRNA与 簇

在基因研究中，基因簇（gene cluster）是指基因家族中来源相同、结构相似和功能相关的基因在染色体上彼此紧邻所构成的串联重复单位。证据表明在基因组中相连紧密的MiRNA能加强对宿主基因的调控。这种共调控作用在细胞信号转导网络调控中是必不可少的，而且比单个的MiRNA介导的作用效果更显著。根据MiRBase中将两个或两个以上pre-MiRNA间的距离小于10Kb作为一个簇。统计获得一共有230个pre-MiRNA形成55个簇，其中最大一个簇包含15个pre-m i RN A，位于第21号染色沐上(66, 000, 737~66, 010, 775)，且该染色体上包含的pre-miRNA簇最多。

Yu等人[53]分析了38个miRNA基因簇内的miRNA成员之问的同源性，发现这些簇生排列的miRNA是通过同一个祖先基因经过局部重复形成的。同时分析38个miRNA基因簇之问的同源性，发现26个基因簇之间具有种内同源的迹象，其中有3个miRNA基因家族一一let-7a-1簇、let-7a-3簇和98簇形成的种内同源miRNA基因家族，29c簇和29a簇形成的家族以及15a簇和16-1簇形成的家族，每个家族内的簇之间和簇内的成员之问依然保持着90%以上的序列相似性和染色体上排列的共线性。由此推测，这些miRNA基因家族是通过片段重复而形成的。

2.Mir-RNA与其他非编码RNA

circRNA是最近加入越来越多的已知ncRNA类型的一种RNA分子。这些RNA通过5-3'连接以及通过在剪接期间由分支点亲核攻击形成的2-5'连接进行环化[35]。circRNA已知至少30年，但由于它们的低表达水平，它们被认为是分子吸虫或异常RNA剪接的产物[36] 。然而，最近的研究揭示了大量的内源性circRNAs，它们丰富，稳定且无处不在表达，并且一些circRNA已显示出特殊的调控作用。最近，哺乳动物中的两种circRNA已经显示出作为miRNA海绵起作用：CDR1as是miR-7的海绵，而由Sry基因（circSry）产生的circRNA是miR-138的海绵[37][38]。环状RNA也可以增强其亲本基因在细胞核中的表达[39]。 circRNAs的表达发育受到调控，并在组织之间变化[40，41]。最近的一项研究发现，大多数小鼠大脑的circRNA也在人脑中表达为circRNA，其中一些在果蝇大脑中被检测到[42]。总之，这些发现表明circRNA的功能在不同的动物物种中是保守的。最近积累的证据表明，circRNA可以作为miRNA海绵或竞争性内源RNA起作用[39];因此，一些circRNA可能会抑制或缓解翻译中miRNA的抑制。

lncRNA是一类超过200个核苷酸的转录本，并且大多数不具有蛋白质编码潜力[43]。目前，许多功能性lncRNA已经被鉴定并被认为是各种生理和病理过程的关键调节因子[44]。尽管已报道许多lncRNA调节癌症[45] 心血管疾病[46]，神经疾病[47]和炎症[48]，在乳腺炎引起的纤维化过程中，lncRNAs介导TGF-β1在牛上皮细胞中的作用和调节EMT的起重要作用[49]。

在Tong等人研究中，在牛乳腺中鉴定了184个lincRNAs，其中包括112个新的miRNA。 另外，在399个独特的不同牛QTL区域内有113个不同的lincRNAs。 特别是，几个lincRNA被置于影响临床乳腺炎，乳质量或产量的QTL中，并且它们参与这些参数值得进一步研究。 此外，新型lincRNA的鉴定显着扩大了用于奶牛的lincRNA的库，因此将有助于理解牛lincRNA的功能。

外泌体是一类胞外囊泡，例如直径为50〜150nm的微泡，凋亡小体或外体，其源自与质膜融合的MVB[57]。外泌体可从许多细胞类型中释放，包括上皮细胞，内皮细胞，免疫细胞，血小板，血细胞和平滑肌细胞[58,59]。在健康和病态条件下，已经在许多体液中发现了外泌体，包括血液，羊水，尿液，恶性腹水，脑脊液，母乳，唾液，淋巴和胆汁[60,61,62]。直到20世纪90年代中期，外泌体才被证明具有免疫功能[63]。自那以后，许多研究已经将外泌体鉴定为细胞间通讯的一种手段，它在正常的生理或生物学重要过程中发挥作用，如泌乳，炎症，细胞增殖，免疫反应和神经元功能[64,65,66]。已发现外泌体具有抗炎功能。在小鼠模型中，从过度表达IL-4或IL-10的树突细胞释放的外体以MHC-II依赖性方式抑制迟发型超敏反应。这些外泌体也能抑制胶原诱导性关节炎的发作并降低其严重程度[67,68]。牛奶外泌体表现出跨物种耐受性，没有不利的免疫和炎症反应，这可以被认为是提高口服生物利用度并改善药物的功效和安全性的载体[69]。

在另一项研究中，miRNA在外泌体中被检测到，并显示作为功能分子被递送到另一个细胞[70]。随后，许多研究集中于外泌体miRNA的功能。例如，来源于尿外泌体的miR-29c被发现为肾脏纤维化的新型非侵入性标志物[71]。此外，发现miR-21富含血清外泌体，可能成为肝细胞癌的潜在生物标志物[72]。此外，miR-146a / b在感染后乳汁外泌体中也显着上调。我们的研究结果提供了关于在牛奶外泌体中差异表达的miRNAs以及可能成为乳腺炎早期诊断检测的潜在候选者的特定miRNA的重要信息。

3.MiRNA与SNPs

启动子是基因最重要的调控区，决定着第一步信使RNA的转录，如何从基因组中快速地识别出启动子并发现其中包含的信息，是弄清启动子的结构特点，启动规律以及与其它因子的相互作用的关键，更是研究基因表达模式，基因调控网络，细胞特异性等方面的基础。而位于基因5`调控区或核心启动子区域的SNP会导致某些核心启动子的功能缺失，增强子丢失，转录因子结合位点改变，降低或增强基因表达。也有相关报道，Nramp 1基因启动子区域的SNP对Nramp 1基因的转录调控以及与免疫抑制性疾病相关[54]，在Lf基因的启动子区SNP与奶牛乳腺炎具有相关性[55 ]，这些都说明功能性SNP对奶牛乳腺炎抗性相关基因的启动子进行调控，并且与奶牛乳腺炎相关联。

 奶牛基因多态性位点与生产性状和抗乳房炎相关性分析的研究比较广泛，涉及多个基因，包括丛生蛋白基因(clusterin ) ，牛乳铁蛋白基因 , IL,8基因 ,TLR4基因,和PGLYRP-1等等，这些基因本身参与产奶量或者免疫应答的遗传调节。NF-kB通路基因多态性与奶牛生产形状和抗乳房炎相关。

四、展望

今后相关研究应关注乳腺发育和泌乳相关miRNA 的表达分析和功能验证。miRNA 的表达分析应着眼于发现乳腺组织特异性表达的miRNA, 探讨乳汁体细胞中miRNA 与乳腺组miRNA 的相关性, 筛选miRNA 的分子标记。对于miRNA 的功能验证方面, 应该深入研究功能miRNA 的作用机理,外界因素对miRNA 的表达调控以及如何利用miRNA 来调控乳腺健康和高质高效产乳。应当在细胞水平研究基础上加强在体试验验证, 加强miRNA抑制和过表达方面的探索。可以预见, miRNA 的深入研究将进一步揭示乳腺正常和异常发育及泌乳的机理, 可为促进乳腺健康发育和调控高质高效产乳,治疗乳腺癌、乳腺炎等各种乳腺疾病提供新的思路。

参考文献

1. Gigli I, Maizon DO: microRNAs and the mammary gland: A new understanding of gene expression. Genet Mol Biol. 2013; 36(4): 465–474.

2. Jin HY, Xiao C: MicroRNA mechanisms of action: What have we learned from mice? Front Genet. 2015; 6: 328.

3. Rinaldi M, Li RW & Capuco AV 2010 Mastitis associated transcriptomic disruptions in cattle. Veterinary Immunology and Immunopathology 138267–279

4. Trigo G, Ferreira P, Ribeiro N, Dinis M, Andrade EB, Melo-Cristino J,Ramirez M& Tavares D 2008 Identification of immunoreactive extracellular proteins of Streptococcus agalactiae in bovine mastitis. Canadian Journal of Microbiology 54 899–905

5. Jin W, Ibeagha-Awemu EM, Liang G, Beaudoin F, Zhao X & Guan LL 2014 Transcriptome microRNA profiling of bovine mammary epithelial cells challenged with Escherichia coli or Staphylococcus aureus bacteria reveals pathogen directed microRNA expression profiles. BMC Genomics 15 181

6. Dilda F, Gioia G, Pisani LF, Restelli L, Lecchi C, Albonico F, Bronzo V, Mortarino M & Ceciliani F 2012 Escherichia coli lipopolysaccharides and Staphylococcus aureus enterotoxin B differentially modulate inflammatory microRNAs in bovine monocytes. Veterinary Journal 192 514–516

7. Li Z, Liu H, Jin X, Lo L and Liu J (2012) Expression profiles of microRNAs from lactating and non-lactating bovine mammary glands and identification of miRNA related to lactation.BMC Genomics 13:731.

8. Wang J, Bian Y, Wang Z, Li D, Wang C, Li Q, Gao X.2014. MicroRNA-152 regulates DNA methyltransferase 1 and is involved in the development and lactation of mammary glands in dairy cows. PLoS One 9:e101358

9. Bian Y, Lei Y, Wang C, Wang J, Wang L, Liu L, Liu L, Gao X, Li Q (2015) Epigenetic regulation of miR-29s affects the lactation activity of dairy cow mammary epithelial cells. J Cell Physiol 230:2152–2163

10. Li D, Xie X, Wang J, Bian Y, Li Q, Gao X, Wang C (2015)MiR-486 regulates lactation and targets the PTEN gene in cow mammary glands. PLoS One 10:e0118284

11.  Ji Z, Wang G, Xie Z, Wang J, Zhang C, Dong F, Chen C(2012) Identifi cation of novel and differentially expressed MicroRNAs of dairy goat mammary gland tissues using solexa sequencing and bioinformatics. PLoS One 7:e49463

12.  Wang M, Moisá S, Khan MJ, Wang J, Bu D and Loor JJ. (2012)MicroRNA expression patterns in the bovine mammary gland are affected by stage of lactation. J Dairy Sci. 9:6529-6535.

13. Peng J, Zhao JS, Shen YF, Mao HG, Xu NY (2015)MicroRNA expression profi ling of lactating mammary gland in divergent phenotype swine breeds. Int J Mol Sci 16:1448–1465

14.Zhang C, Zhao Y, Wang Y, Wu H, Fang X, Chen H (2014)Deep RNA sequencing reveals that microRNAs play a key role in lactation in rats. J Nutr 144:1142–1149

15. Wang M, Moisa S, Khan MJ, Wang J, Bu D, Loor JJ. MicroRNA expression patterns in the bovine mammary gland are affected by stage of lactation. JDairy Sci, 2012, 95(11):6529-6535.

16. Avril-Sassen  S,  Goldstein  LD,  Stingl  J,  Blenkiron  C,  Le Quesne J, Spiteri I, Karagavriilidou K, Watson CJ, Tavaré S,  Miska  EA,  Caldas  C.  Characterisation  of  micro RNA  expression  in  post-natal  mouse  mammary  gland  development. BMC Genomics, 2009, 10: 548.

17. Sdassi N, Silveri L, Laubier J, Tilly G, Costa J, Layani S, Vilotte  JL,  Le  Provost  F.  Identification  and  characteriza-tion of new mi RNAs cloned from normal mouse mammary gland. BMC Genomics, 2009, 10: 149.  

18.Vimalraj S & Selvamurugan N 2013 MicroRNAs: synthesis, gene regulation and osteoblast differentiation. Current Issues in Molecular Biology 15 7–18

19.Naeem A, Zhong K, Moisá SJ, Drackley JK, Moyes KM & Loor JJ 2012 .Bioinformatics analysis of microRNA and putative target genes in bovine mammary tissue infected with Streptococcus uberis. Journal of Dairy Science 95 6397–6408

20.Fazi F, Rosa A, Fatica A, Gelmetti V, Marchis MLD, Nervi C & Bozzoni I.2005. A minicircuitry comprised of microRNA-223 and transcription factors NFI-A and C/EBPα regulates human granulopoiesis. Cell 123819–831

21.Johnnidis JB, Harris MH, Wheeler RT, Stehling-Sun S, Lam MH, Kirak O,Brummelkamp TR, Fleming MD & Camargo FD 2008 Regulation of progenitor cell proliferation and granulocyte function by microRNA-223.Nature 451 1125–1129

22.Haneklaus M, Gerlic M, O’Neill LA & Masters SL 2013 miR-223: infection,inflammation and cancer. Journal of Internal Medicine 274 215–226

23.Jing Q, Huang S, Guth S, Zarubin T, Motoyama A, Chen JM, Padova FD,Lin SC, Gram H & Han JH 2005 Involvement of microRNA in AU-rich element-mediated mRNA instability. Cell 120 623–634

24.Chen L, Liu X, Li Z, Wang H, Liu Y, He H, Yang J, Niu F, Wang L & Guo J.2014. Expression differences of miRNAs and genes on NF-κB pathway between the healthy and the mastitis Chinese Holstein cows. Gene545 117–125

25.Luoreng ZM, Wang XP, Mei CG, Zan LS 2018 Comparison of microRNA Profiles between Bovine Mammary Glands Infected with Staphylococcus aureus and Escherichia coli.Int J Biol Sci. 14(1):87-99. doi:

26.Dietz, A. B., J. C. Detilleux, A. E. Freeman, D. H. Kelley, J. R. Stable, and M. E. Kehrli Jr. 1997. Genetic association of bovine lymphocyte antigen DRB3 haplotypes with immunological traits of Holstein Cattle. J. Dairy Sci. 80:400–405.

27.Kelm, S. C., J. C. Detilleux, A. E. Freeman, M. E. Kehrli Jr., A. B. Dietz, L. K. Fox, J. E. Butler, I. Kasckovics, and D. H. Kelley. 1997. Genetic association between parameters of innate immunity and measures of mastitis in periparturient Holstien cattle. J. Dairy Sci. 72:1767–1775.

28.Sharif, S., B. A. Mallard, B. N. Wilkie, J. M. Sargeant, H. M. Scott, J. C. Dekkers, and K. E. Leslie. 1998. Association of the bovine major histocompatibility complex DRB3 (BoLA-DRB3) haplotypes with occurrence of disease and milk somatic cell score in Canadian dairy cattle. Anim. Genet. 29:185–193.

29.Kulberg, S., B. Heringstad, O. A. Guttersrud, and I. Olsaker. 2007. Study on the association of BoLA-DRB3.2 alleles with clinical mastitis in Norwegian Red cows. J. Anim. Breed. Genet. 124:201–207.

30.Rupp, R., A. Hernandez, and B. A. Mallard. 2007. Association of bovine leukocyte antigen (BoLA) DRB3.2 with immune response, mastitis, production and type traits in Canadian Holsteins. J. Dairy Sci. 90:1029–1038.

31.Starkenburg, R. J., L. B. Hansen, M. E. Kehrli Jr., and H. ChesterJones. 1997. Frequencies and effects of alternative DRB3.2 alleles of bovine lymphocyte antigen for Holsteins in milk selection and control lines. J. Dairy Sci. 80:3411–3419.

32.do Nascimento, C. S., M. A. Machado, M. L. Martinez, M. V. G. B. da Silva, M. F. M. Guimarães, A. L. Campos, A. L. S. Azevedo, R. L. Teodoro, R. D. S. Verneque, S. E. F. Guimarães, and D. A. A. Oliveira. 2006. Association of the bovine major histocompatibility complex (BoLA) BoLA-DRB3 gene with fat and protein production and somatic cell score in Brazilian Gyr dairy cattle (Bos indicus). Genet. Mol. Biol. 29:641–647.

33.Duangjinda M1, Buayai D, Pattarajinda V, Phasuk Y, Katawatin S, Vongpralub T, Chaiyotvittayakul A.2009.

Detection of bovine leukocyte antigen DRB3 alleles as candidate markers for clinical mastitis resistance in Holstein x Zebu.J Anim Sci. 87(2):469-76.

34. Jones, G. M., and T. L. Bailey 2009 Understanding the basics of mastitis. Virginia Cooperative Extension Publication No. 404-233. Virginia State University, USA, 1-7 

35. 李惠侠，王振云，张震，等。高温条件下miRNA-24对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响(Jl。中国农业科学，2010, 43(22): 4732-38a

36.Naeem A, Zhong K, Moisá SJ, Drackley JK, MoyesKMand Loor JJ (2012) Bioinformatics analysis of microRNA and putative target genes in bovine mammary tissue infected with Streptococcus uberis 1. J Dairy Sci 95:6397-6408.

37.Xie W, Li Z, Li M, Xu N and Zhang Y (2013) miR-181a and inflammation:miRNA homeostasis response to inflammatory stimuli in vivo. Biochem Biophys Res Commun 430:647-652.

38.Lawless N, Foroushani ABK, McCabe MS, O’Farrelly C and Lynn DJ (2013) Next generation sequencing reveals the expression of a unique miRNA profile in response to a Grampositive bacterial infection. PLoS One 8:e57543.

39. Yu J, Wang F, Yang GH, Wang FL, Ma YN, Du ZW  micrvRNA clusters: genomic organization and expression cell lines. Biochem Biophys Res Commun 2006, 349:59-68.Zhang JW: Human profile in leukemia

40.Lasda, E., and R. Parker. 2014. Circular RNAs: Diversity of form and function. RNA 20:1829–1842.

41.Sanger, H. L., G. Klotz, D. Riesner, H. J. Gross, and A. K. Kleinschmidt. 1976. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3852–3856.

42.Hansen, T. B., T. I. Jensen, B. H. Clausen, J. B. Bramsen, B. Finsen, C. K. Damgaard, and J. Kjems. 2013. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature 495:384–388.

43.Memczak, S., M. Jens, A. Elefsinioti, F. Torti, J. Krueger, A. Rybak, L. Maier, S. D. Mackowiak, L. H. Gregersen, M. Munschauer, A. Loewer, U. Ziebold, M. Landthaler, C. Kocks, F. leNoble, and N. Rajewsky. 2013. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 495:333–338.

44.Li, Z., C. Huang, C. Bao, L. Chen, M. Lin, X. Wang, G. Zhong, B. Yu, W. Hu, L. Dai, P. Zhu, Z. Chang, Q. Wu, Y. Zhao, Y. Jia, P. Xu, H. Liu, and G. Shan. 2015. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nat. Struct. Mol. Biol. 22:256–264.

45.Fan, X., X. Zhang, X. Wu, H. Guo, Y. Hu, F. Tang, and Y. Huang. 2015. Single-cell RNA-seq transcriptome analysis of linear and circular RNAs in mouse preimplantation embryos. Genome Biol. 16:148.

46.You, X., I. Vlatkovic, A. Babic, T. Will, I. Epstein, G. Tushev, G. Akbalik, M. Wang, C. Glock, C. Quedenau, X. Wang, J. Hou, H. Liu, W. Sun, S. Sambandan, T. Chen, E. M. Schuman, and W. Chen. 2015. Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulated by development and plasticity. Nat. Neurosci. 18:603–610.

47.Rybak-Wolf, A., C. Stottmeister, P. Glažar, M. Jens, N. Pino, S. Giusti, M. Hanan, M. Behm, O. Bartok, R. Ashwal-Fluss, M. Herzog, L. Schreyer, P. Papavasileiou, A. Ivanov, M. Öhman, D. Refojo, S. Kadener, and N. Rajewsky. 2015. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Mol. Cell 58:870–885.

48.Kwok ZH, Tay Y. 2017. Long noncoding RNAs: lincs between human health and disease. Biochemical Society Transactions 45:805–812 DOI 10.1042/BST20160376.

49.Engreitz JM, Ollikainen N, Guttman M. 2016. Long non-coding RNAs: spatial amplifiers that control nuclear structure and gene expression. Nature Reviews. Molecular Cell Biology 17:756–770 DOI 10.1038/nrm.2016.126

50.Yuan JH, Yang F, Wang F, Ma JZ, Guo YJ, Tao QF, Liu F, Pan W, Wang TT, Zhou CC, Wang SB, Wang YZ, Yang Y, Yang N, Zhou WP, Yang GS, Sun SH. 2014. A long noncoding RNA activated by TGF-beta promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma. Cancer Cell 25:666–681 DOI 10.1016/j.ccr.2014.03.010.

51.Archer K, Broskova Z, Bayoumi AS, Teoh JP, Davila A, Tang Y, Su H, Kim IM. 2015. Long non-coding RNAs as master regulators in cardiovascular diseases. International Journal of Molecular Sciences 16:23651–23667 DOI 10.3390/ijms161023651.

52.Briggs JA, Wolvetang EJ, Mattick JS, Rinn JL, Barry G. 2015. Mechanisms of long noncoding RNAs in mammalian nervous system development, plasticity, disease, and evolution. Neuron 88:861–877 DOI 10.1016/j.neuron.2015.09.045.

53.Zacharopoulou E, Gazouli M, Tzouvala M, Vezakis A, Karamanolis G. 2017. The contribution of long non-coding RNAs in Inflammatory Bowel Diseases. Digestive and Liver Disease 49(10):1067–1072 DOI 10.1016/j.dld.2017.08.003.

54.Yang W, Li X, Qi S, Li X, Zhou K, Qing S, Zhang Y, Gao MQ.2017.lncRNA H19 is involved in TGF-<i>β</i>1-induced epithelial to mesenchymal transition in bovine epithelial cells through PI3K/AKT Signaling Pathway.PeerJ. 5:e3950.

55.Kowal J, Arras G, Colombo M, Jouve M, Morath JP, Primdal-Bengtson B, Dingli F, Loew D, Tkach M, Théry C (2016) Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci 113(8): E968–E977.

56.Liao J, Liu R, Yin L, Pu Y (2014) Expression profiling of exosomal miRNAs derived from human esophageal cancer cells by Solexa high-throughput sequencing. Int J Mol Sci 15(9):15530–15551.

57.Saunderson SC, Dunn AC, Crocker PR, McLellan AD (2014) CD169 mediates the capture of exosomes in spleen and lymph node. Blood 123(2):208–216.

58.Taylor, D.D.; Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 2008, 110, 13–21.

59.  Simpson, R.J.; Lim, J.W.; Moritz, R.L.; Mathivanan, S. Exosomes: Proteomic insights and diagnostic potential.Expert Rev. Proteom. 2009, 6, 267–283.

60.Gallo, A.; Tandon, M.; Alevizos, I.; Illei, G.G. The majority of microRNAs detectable in serum and saliva is concentrated in exosomes. PLoS ONE 2012, 7, e30679.

61.Raposo, G.; Nijman, H.W.; Stoorvogel, W.; Liejendekker, R.; Harding, C.V.; Melief, C.J.; Geuze, H.J.B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. J. Exp. Med. 1996, 183, 1161–1172.

62.Admyre, C.; Johansson, S.M.; Qazi, K.R.; Filen, J.J.; Lahesmaa, R.; Norman, M.; Neve, E.P.; Scheynius, A.;Gabrielsson, S. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol.2007, 179, 1969–1978.

63. Simhadri, V.R.; Reiners, K.S.; Hansen, H.P.; Topolar, D.; Simhadri, V.L.; Nohroudi, K.; Kufer, T.A.; Engert, A.;Pogge von Strandmann, E. Dendritic cells release HLA-B-associated transcript-3 positive exosomes to regulate natural killer function. PLoS ONE 2008, 3, e3377.

64. Gu, Y.; Li, M.; Wang, T.; Liang, Y.; Zhong, Z.; Wang, X.; Zhou, Q.; Chen, L.; Lang, Q.; He, Z.; et al.Lactation-related microRNA expression profiles of porcine breast milk exosomes. PLoS ONE 2012, 7, e43691.

65.  Kim, S.H.; Lechman, E.R.; Bianco, N.; Menon, R.; Keravala, A.; Nash, J.; Mi, Z.; Watkins, S.C.; Gambotto, A.;Robbins, P.D. Exosomes derived from IL-10-treated dendritic cells can suppress inflammation and collagen-induced arthritis. J. Immunol. 2005, 174, 6440–6448.

66. Kim, S.H.; Bianco, N.R.; Shufesky, W.J.; Morelli, A.E.; Robbins, P.D. Effective treatment of inflammatory disease models with exosomes derived from dendritic cells genetically modified to express IL-4. J. Immunol.2007, 179, 2242–2249.

67.Munagala R, Aqil F, Jeyabalan J, Gupta RC (2016) Bovine milk-derived exosomes for drug delivery. Cancer Lett 371(1):48–61.

68.Valadi H, Ekström K, Bossios A, Sjöstrand M, Lee JJ, Lötvall JO (2007)Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol 9(6):654–659.

69.Lv L-L, Cao YH, Ni HF, Xu M, Liu D, Liu H, Chen PS, Liu BC (2013) MicroRNA-29c in urinary exosome/microvesicle as a biomarker of renal fibrosis. Am J Physiol Renal Physiol 305(8):F1220–F1227.

70.张利博.牛Nrampl基因5'端调控区的启动子功能和SNP分析[Dl.吉林大学.2009.

71.王洪梅，孔振兴，王长法，等。奶牛乳铁蛋白基因5’侧翼区遗传多态性及其与乳腺炎关联性分析[J]。遗传，2009,31(4): 393-9a。