MicroRNA181-c在颅内出血患者中的表达以及与疾病严重程度关系的研究

        卢希1   何志义1

（1 中国医科大学附属第一医院 沈阳 110001 中国）

目的：探讨microRNA181-c在颅内出血以及对照组中的表达差异，以及是否与临床症状表现存在相关性。 方法：按照入组标准研究颅内出血22例，对照组18例患者，采集相关外周血标本行PCR检测microRNA181-c的表达。结果：颅内出血组以及对照组的miR-181c的表达存在差异性，但其表达量与颅内出血量存在负相关性。结论：miR-181c的表达是颅内出血的保护因素，可能与颅内出血的临床症状相关，是抗凋亡相关的基因。

  Expression of MicroRNA-181c in Intracranial lHemorrhage Patients and Relationship with severity

                 Lu Xi ¹ , He Zhiyi¹

（ The first hospital of China Medical University  Shenyang  110001 China）

Objective: To investigate the difference in the expression of microRNA181-c in intracranial hemorrhage and the control group, and whether there is a correlation with the clinical symptoms. Methods: According to the standard of intracranial hemorrhage in 22 cases, 18 patients in the control group, the expression of   microRNA181-c using PCR acquisition in the peripheral blood. Results: There was a difference in the expression of miR-181c in the intracranial hemorrhage group and the control group, but there was significant correlation between the expression of intracranial hemorrhage and the amount of intracranial hemorrhage. Conclusion: The expression of miR-181c is a protective factor for cerebral hemorrhage, and it is also related to the clinical symptoms of intracranial hemorrhage. It may be a gene for anti-promoting apoptosis.

关键词：颅内出血;miR-181c;Bcl-2;Bax;凋亡

Key: intracranial hemorrhage; miR-181c; Bcl-2; Bax;apoptosis

颅内出血的发生率占所有卒中发生率的1

-15%，且伴有较高的死亡率和致残率。尽管在过去的10年中有较多关于脑梗死治疗技术等试验，但关于颅内出血治疗的比较少。有些关于重要治疗的试验包括有凝血因子VIIa和神经保护因子都没有取得预期的结果，目前关于颅内出血治疗的知道意见仅限于血压和其他并发症等治疗。目前关于区分颅内出血机制的研究是期望较高的，希望对于临床治疗起到一定启示作用。本文主要研究miR-181c在颅内出血患者中及与出血量相关性的研究，提出miR-181c在颅内出血中的可能作用机制。

1、 材料和方法

1.1研究对象

采用回归性分析方法，收集于2017年3-5月就诊于中国医科大学附属第一医院以及体检中心的40例患者，其中脑出血22例，来自体检中心体检患者18例。对于脑出血入组的标准包括：1、年龄≥18岁；2、患者在发病72小时内入组；3、排除标准为继发性出血，包括脑部肿瘤、出血性梗死或使用溶栓引起的出血，最近3个月内有脑卒中病史或拒绝参加的情况。本研究经医院医学伦理委员会批准，并经患者知情同意。入院时收集入组患者的一般信息及临床信息如下表1。同时患者脑出血采用非对比CT进行检测，脑出血量有三位医师进行双盲性测算。

表1 患者一般信息及临床信息

1.2 研究方法

1.2．1 miRNA试剂及仪器

    miＲcute miＲNA 提取分离试剂盒( 天根公司) ; 逆转录试剂盒和 PCＲ 扩增试剂盒( 美国 ABI 公司)；光学/荧光倒置显微镜( 日本 Olympus 公司) ;酶联仪( 美国 Bio-Ｒad 公司) ; 蛋白质核酸分析仪( 美国 Pharmacia 公司)。

1.2.2 标本采集及RNA提取

   入组受试均抽取外周静脉血2毫升，含有EDTA-K2抗凝剂。按miR-cute RNA提取分离试剂盒说明提取血中总RNA，应用NanoDrop ND-1000分析仪检测RNA的浓度及纯度，选取吸光度值（A260/A280mm）为1.8-2.1标本于后续试验

1.2.3  实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测血中miR-181c的表达

按逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA,置于-20°C保存。miR-181c和U6荧光定量PCR引物于探针由美国ABI公司设计并合成。合成物分别是：U6 :5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’;hsa-miR-181c GSP:5' GGGGAACATTCAACCTGTCG3’ PCR总反应体系为8ul，包括2 × Master Mix ,5 µl;10uM 的PCR特异引物F ,0.5µl;10uM 的PCR特异引物R,0.5µl。PCR循环参数：95°C预顺性 10min；95°C 15秒，60°C退火及延伸1min,,共45个循环。于每个循环的延伸阶段各采集1次荧光信号，用7500system SDS软件进行分析。MiR-181c 的相对表达量用ΔCt法表示，ΔCt = Ct miＲ-181c － CtU6。

1.2.4 统计学方法

 所有资料通过Epidata 3.0 进行数据录入，并采用SPSS 进行统计学分析。本研究统计学方法采用独立样本T检验，多因素分析采用Logitsitc回归分析。P<0.05存在统计学差异。

2、 结果

2.1 microRNA 181-c 的表达水平在颅内出血的患者中较对照组下降

  在本研究中，为了评估ICH后miRNA的凋亡情况，我们检测了miR-181c在ICH患者和健康人群中血清中的表达。共采集血清40份，T-PCR分析显示ICH患者血浆中miR-181c<水平较健康人群下降,表达组间有统计学差异p=0.03<0.05，说明颅内出血组与对照组在miR-181c在表达上存在差异，miR-181c为颅内出血的一个抗凋亡基因，高表达可减少颅内出血的机会。

              表1  颅内出血组与对照组microRNA181c的表达比较

图1  miR-181c在颅内出血组和健康对照组中表达的差异

2.2 分析脑出血患者中miR-181c的表达与颅内出血量是否存在相关性

在入组颅内出血患者中，应用多田公式计算相关入组患者的出血量（血肿量=血肿长径×宽径×厚度，即 V=ABC/2）颅内出血量，按颅内出血量将患者分为3组，入院时颅内出血量小于10ml者为6例，定义为小量组；10-30ml者为12例，定义为中量组；大于30ml者为4例，定义为大量组。（表2）

将颅内出血量与患者血浆将micrRNA结果行相关性分析，以颅内出血量为自变量X，以microRNA指标为Y做回归性分析所得结果如下，患者血浆microRNA与出血量的回归性方程为a=6.543,b=-0.047,Y=6.543-0.047*颅内出血量,经方差分析F检验，得F=29.558，经t 检验，p结果提示有明显相关性（P<0.01）(图2)，即microRNA181-c的表达量多少与颅内出血量存在明显相关关系，而且为负相关性，说明颅内出血量约大，miR-181c的表达越低，进一步说明miR-181c为颅内出血的保护因子，是抗凋亡作用的。

   表2 各组不同量颅内出血的相对miRNA的表达量

图2 颅内出血量与miR-181c相对表达量的相关性关系 

3、讨论

目前较多研究关于microRNA-181c在缺血性卒中中的研究较多^[1-4]，但关于miR-181c在脑出血中的研究较少。本文研究关于颅内出血患者中miR-181c的表达与正常人群中的表示否存在差异，以及与临床症状的相关性。

 我们的研究发现has-miR-181c的水平表达在颅内出血中的患者的血浆中表达是下降的。这个结果跟以前的相关研究一直，例如Jeyaseelan^[4]等对于短暂性缺血发作的小鼠模型中脑组织中miR-181c的水平是下降的，和Qingfeng^[5]等关于miR-181c在脑梗死的患者外周血中的研究。我们的研究表明miR-181c的表达可以是颅内出血的一个潜在保护因素，它的低表达可能增加脑出血的风险，是一个抑制凋亡过程的主要因素。同时进一步研究miR-181c的表达量与颅内出血量的多少可能存在一个负相关性，可能预测颅内出血临床症状的评估，但由于存在由于入组患者较少，仅存在一定的提示意义，后期需腰应用大样本数据进一步验证。

MiR-181家族在免疫调节以及凋亡过程中扮演重要的角色。细胞的凋亡途径分两类，一种为内源性/线粒体途径，另一种是外源性/死亡受体途径^[6]。线粒体是在内源性途径中执行凋亡过程的核心，其中包括供能、信号转导、细胞分化和生长，同时通过控制诱导凋亡的信号转到过程中决定细胞的死亡和生存。在凋亡过程中，线粒体分解成许多小片段，大于2000种蛋白在线粒体中被发现，这些蛋白大多数是从基因转录和表达中获得到。而调控线粒体途径凋亡的主要调控者是Bcl-2家族，其中包括了促凋亡和抗凋亡蛋白两种^[1、7-10]但以抑制凋亡为主。Bcl-2蛋白可激活或抑制一个线粒体通透性转化孔的稳定性，而这个步骤是一个在凋亡中重要的抑制过程，而这个过程是通过调节细胞质内的Ca2+、PH的通道完成。同时凋亡过程也可能是Bcl-2家族的促凋亡成员诱导线粒体释放细胞色素C和其他凋亡因子的进入细胞溶质，然而抗凋亡的成员抑制这些因子的释放^[11、12]。从线粒体释放出的细胞色素C导致下游半胱天冬酶（细胞凋亡蛋白酶）串联反应激活，这个被看为细胞死亡过程中不可逆的一个过程点^{[13、14、15]}。促生存的Bcl-2蛋白通过直接作用在促凋亡的膜上来抑制线粒体外层膜的通透性^[16]。这个存在于细胞质和线粒体内的复杂网路机制决定了细胞的命运^{[17、18、19]}。MiRNAs在DNA的复制、染色体的维持、翻译的活性、RNA的过程、翻译和稳定性，和蛋白移位的调节中起到重要作用。进一步研究表明miR-181c的调控基因与抗凋亡相关，考虑与Bcl-2相关且miR-181c靶点在Bcl-2的3′-非翻译区(3′-UTR)^[20]。同时miR181-c还可以干预由TNF-α介导的凋亡通路。有研究表明，氧糖剥夺可以上调IL-1b，TNF-α和Inos^[21]。INF-α是在缺血实践中比较重要的一个促炎症细胞因子，高水平的TNF-α与多种感染、神经病理、神经退化和神经中毒状态相关^[22]。肿瘤坏死因子α诱发凋亡的机制有多种，特别是有线粒体依赖和非线粒体依赖途径，这两个途径的主要区别在于半胱天冬酶8的活化范围^[23]。活化的半胱天冬酶8，调控促凋亡蛋白Bid形成切去顶端的形式，这个可以转到线粒体内。这个过程减低线粒体膜的潜能，导致的释放细胞色素c。细胞色素c，与凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf1）以及促半胱天冬酶9的始动者，共同形成凋亡体复合物^[24]。这个凋亡体复合物激活其他半胱天冬酶包括3和7，导致细胞凋亡，同时使线粒体双层膜破裂，在TNF-α诱导凋亡时减少或缺失嵴进一步使线粒体破裂引起细胞的凋亡^[25、26]。同时研究发现TNF-α是受miRNA调控的，而这个过程是通过miR-181c调控的，其能够直接与3′-非翻译区(3′-UTR)相结合。另有研究表明MiR-181c的异位表达可导致从胶质细胞释放的TNF-α减少和神经元凋亡的减少^[27]。进一步来说，miR-181c在TNF-α凋亡过程中可以调控凋亡蛋白Bcl-2、cyto-c和半胱天冬酶-3，Bcl-2与miR-181c的作用是相互的^[29-31]。

总的来说，miR-181c的主要作用靶点是Bcl-2，而且Bcl-2的改变可以负反馈调节miR-181c的表达。在脑出血的患者血浆中miR-181c的表达是减少的，对于凋亡存在抑制作用。

本文章由国家自然基金项目81571120支持。

参考文献

[1] Huang S, Wu S, Ding J, Lin J, Wei L, Gu J, He X. MicroRNA-181a modulates gene expression of zinc finger family members by directly targeting their coding regions. Nucleic Acids Res, 2010, 38(20): 7211–7218.

[2] Bohacek I，Cordeau P，Lalancette-Hebert M，et al. Toll like receptor 2 deficiency leads to delayed exacerbation of ischemic injury［J］．J Neuroinflammation，2012，9:191

[3] Zhang Q, Sun H, Jiang Y, Ding L, Wu S, Fang T, et al. MicroRNA-181a suppresses mouse granulosa cell proliferation by targeting activin receptor II[J]. P LoS One,2013,8: 59667

[4] Jeyaseelan,  Xu L, Giffard RG . Inhibition of microRNA-181 reduces forebrain ischemia-induced neuronal loss[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2013,33:1976-1982.

[5] Qing feng Ma, Haping Zhao, Zhen Tao, et al. MicroRNA-181c exacerbates brain injury in acute ischemic stroke [J]. Aging and Disease ,2016,7(6):705-714.

[6] Maestrini I, Strbian D, Gautier S, et al. Higher neutrophil counts before thrombolysis for cerebral ischemia predict worse outcomes[J]. Neurology,2015,85:1408-1416

[7] Hyun S, Kwon S, Cho S, et al. Can the Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio Appropriately Predict Carotid Artery Stenosis in Patients with Ischemic Stroke? -A Retrospective Study[J]. J Stroke Cerebrovasc Dis, 2015,24:2646-265.

[8] R. Duan, L. Han, Q. Wang, et al. HOXA13 is a potential GBM diagnostic marker and promotes glioma invasion by activating the Wnt and TGF-b pathways[J]. Oncotarget ,2015,6 (29):27778-27793.

[9] Zhang L, Li YJ, Wu XY, et al. MicroRNA-181c negatively regulates the inflammatory response in oxygen-glucose-deprived microglia by targeting Toll-like receptor 4[J]. J Neurochem, 2015,132:713-723.

[10] Zhou, W. et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis[J]. Cancer Cell,2014, 25, 501–515.

[11] Sand M. et al. Expression of microRNAs in basal cell carcinoma[J]. Br. J. Dermatol. 2012,167, 847–855.

[12] Polimeni M. & Prato, M. Host matrix metalloproteinases in cerebral malaria: new kids on the block against blood-brain barrier integrity? [J]. Fluids Barriers CNS 2014,11, 1.

[13] A Kos, N Olde Loohuis, J Meinhardt, et al. MicroRNA-181 promotes synaptogenesis and attenuates axonal outgrowth in cortical neurons[J]. Cell. Mol. Life Sci,2015,6;

[14] Bicker S, Lackinger M, Weiss K, Schratt G . MicroRNA-132, -134, and -138: a microRNA troika rules in neuronal dendrites[J]. Cell Mol Life Sci ,2014,71:3987–4005.

[15] Iyer AN, Bellon A, Baudet ML. MicroRNAs in axon guidance[J]. Front Cell Neurosci ,2014,8:78.

[16] Gallagher D, Voronova A, Zander MA, et al. Ankrd11 is a chromatin regulator involved in autism that is essential for neural development[J]. Dev Cell,2015, 32:31–42.

[17] Malik AR, Urbanska M, Gozdz A, et al. Cyr61, a matricellular protein, is needed for dendritic aborization of hippocampal neurons[J]. J Biol Chem,2013,288:8544–8559.

[18] Sun X, Sit A, Feinberg MW . Role of miR-181 family in regulating vascular inflammation and immunity[J]. Trends Cardiovasc Med ,2014,24:105–112 .

[19] Chen JQ, Cammarata PR, Baines CP, et al. Regulation of mitochondrial respiratory chain biogenesis by estrogens/estrogen receptors and physiological, pathological and pharmacological implications. Biochim Biophys Acta. 2009; 1793: 1540–70

[20] Murphy E, Steenbergen C. What makes the mitochondria a killer? Can we condition them to be less destructive? Biochim Biophys Acta. 2011; 1813: 1302–8

[21] Rolland SG, Conradt B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 2010; 22: 852–8

[22] Adams JM, Cory S. Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential[J]. Curr Opin Immunol. 2007,19:488–496

[23] Eacker SM, Dawson TM, Dawson VL. The interplay of microRNA and neuronal activity in health and disease[J]. Frontiers in Cellular Neuroscience. 2013; 7

[24] Xinhui Sun, Alan Sit, Mark W. Role for miR-181 family in regulating vascular inflammation and immunity[J]. Trens Cardiovasc Med.2014,24(3):105-112.

[25] Chang-Zheng Chen, Steven Schaffert, Rita Fragoso ,et al. Regulation of immune responses and tolerance: the microRNA perspective[J]. Immunol Rev,2013,253:112-128.

[26] Zhang X, Dong W, Zhou H, et al. alpha-2,8-Sialyltransferase Is Involved in the Development of Multidrug Resistance via PI3K/Akt Pathway in Human Chronic Myeloid Leukemia[J]. IUBMB Life. 2015; 67: 77-87

[27] Ma H, Zhou H, Song X, Shi S, Zhang J, Jia L. Modification of sialylation is associated with multidrug resistance in human acute myeloid leukemia[J]. Oncogene. 2015; 34:726-740.

[28] Chen M, Wang M, Xu S, Guo X, Jiang J. Upregulation of miR-181c contributes to chemoresistance in pancreatic cancer by inactivating the Hippo signaling pathway[J].  Oncotarget. 2015; 6: 44466-44479

[29] Volkers G, Worrall LJ, Kwan DH, et al . Structure of human ST8SiaIII sialyltransferase provides insight into cell-surface polysialylation[J]. Nat Struct Mol Biol. 2015; 22: 627-635.

[30] Vaiana CA, Kurcon T, Mahal LK. MicroRNA-424 Predicts a Role for beta-1,4 Branched Glycosylation in Cell Cycle [J]. Progression 2016; 291: 1529-1537

[31] Yan ZX, Zheng Z, Xue W, et al. MicroRNA181a Is Overexpressed in T-Cell Leukemia/ Lymphoma and Related to Chemoresistance[J]. Biomed Res Int. 2015: 197241