牛结节性皮肤病病毒核酸检测能力验证样品制备及其应用评价

邓俊花，林祥梅，吕继洲，梅琳，王彩霞，吴绍强

（中国检验检疫科学研究院,北京，100176）

摘要：为了满足牛结节性皮肤病疫情区域化国家/地区的牛肉相关产品的检疫需求，迫切需要对口岸动物检疫实验室牛结节性皮肤病检测能力进行客观评价，《牛结节性皮肤病核酸检测》（CNCA-17-A04）能力验证计划被实施。该项目制备了牛结节性皮肤病病毒强阳性、弱阳性及阴性样品。健康牛乳作为阴性样品，将病毒重组质粒按比例掺入牛乳制备了强阳性和弱阳性样品，并采用低温真空制成冻干粉盲样；均匀性和稳定性检验证实样品均达到中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求。将能力验证样品编号后通过快递的方式下发给参试实验室，共有20个省、市的27个实验室参加了本次能力验证活动，均采用PCR结合测序比对的方式报告了检测结果，报送结果均为满意，满意率达100％。本次能力验证对提升我国牛结节性皮肤病的检测水平和评估各级实验室检测能力具有重要意义，对有效防范牛结节性皮肤病跨境传入提供了技术保障。

关键词：牛结节性皮肤病；核酸检测；能力验证

Preparation and application evaluation of samples for proficiency testing for Lumpy skin disease virus nucleic acid detection

DENG Jun-hua,LIN Xiang-mei,LV ji-zhou, Mei lin,Wang Cai-xia,WU Shao-qiang

(Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing, 100176 ,China)

Abstract:The proficiency testing for Lumpy skin disease(LSD) virus nucleic acid detection (CNCA-17-A04) was designed and implemented in order to meet the quarantine demand on the import trade of beef and other related products from regionalized countries or regions of LSD,and  objectively evaluate the detection ability of LSD in the port animal quarantine laboratory. Strong positive, weakly positive and negative samples were prepared in this capacity verification project. The negative samples were prepared by the addition of healthy cow's milk; the virus recombinant plasmid was mixed into cow's milk to prepare strong positive and weakly positive samples which

Were made the freeze-dried powder blind samples byvacuum at low temperature.Based on the results of homogeneity and stability test, the samples met the requirements of chinese national accreditation service for conformity assessment. The samples were dispatched to 27 participant labs in 20 provinces or cities. the reports showed that all of labs choosed PCR and sequencing comparison. The testing data were analyzed, and the satisfaction rate is 100%. This ability verification is of great significance for improving the detection level of LSD and evaluating the detection ability of the participants, which provide technical support for effectively preventing the cross-border introduction of LSD in China.

Keywords: Lumpy skin disease; nucleic acid detection; proficiency testing

牛结节性皮肤病（Lumpy skin disease，LSD），又称牛结节疹、牛结节性皮炎或牛疙瘩皮肤病，是一种牛的痘病。该病的临床特征包括发热，皮肤、粘膜和内脏器官出现结节，机体消瘦，淋巴结肿大，皮肤水肿，部分病例死亡。该病还能够引起产奶量暂时性下降，引起公牛暂时或永久性不育，损坏皮张，甚至因为继发细菌感染而导致动物死亡，感染发病率为5%～45%，死亡率为10%。该病是OIE的通报性疾病（《陆生动物诊断试验及疫苗手册》（2018）），是我国《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中的一类传染病，澳大利亚（澳大利亚2013年版名录）、加拿大（加拿大2014年版名录）、美国（美国国家动物卫生通报系统疾病名录）、欧盟（欧盟动物疫情通报系统疾病名录）的通报性疾病。

牛结节性皮肤病最早于1929年在赞比亚发现，1943年传入博茨瓦纳，然后又传入南非，有800多万头牛受到侵袭，造成了重大的经济损失。1957年传入肯尼亚，与绵羊痘和山羊痘一并爆发。1970年向北蔓延至苏丹，1974年向西蔓延至尼日利亚，到了1977年毛里塔尼亚、马里、津巴布韦、索马里和喀麦隆都有该病发生，病死率达到了20%。该病真实的流行状况虽然仍不清楚，但普遍认为该病的流行范围已经覆盖了非洲中部绝大部分地区甚至是整个非洲的绝大部分地区。该病的爆发通常是零星的，主要取决于动物的移运状况、免疫状态以及气候和降雨对媒介生物的影响等，例如以色列和埃及在疫情停息17年后的再度发生就都归结于上述原因。而在非洲大陆以外，中东在2006年、2007年曾爆发该病，毛里求斯（非洲岛国，距离非洲大陆2200公里）在2008年曾爆发该病。2010年以来，确认在此期间曾发生或正在发生该病的国家多达43个，分布于亚欧非三大洲。土耳其、伊拉克、约旦、黎巴嫩在2013年首次发生该病，阿塞拜疆、伊朗在2014年首次发生该病，其中土耳其疫情严重已经无法控制进而被列为该国的地方性流行病，这些疫情都说明该病已经在中东地区日益严重不断蔓延。近年来，俄罗斯、南非等金砖国家的疫情不容忽视。我国还从未发生过牛结节性皮肤病。

LSDV可借助苍蝇、蜱等媒介机械传播。同时，疫情传播数据表明LSDV可借助牛肉、精液、乳制品等产品传播，而且持续时间较长。

为了应对LSD区域化国家或者地区的牛肉等相关产品输华贸易需求，迫切需要对口岸动物检疫实验室LSDV检测能力进行客观评价，同时，间接提升相关动物检疫实验室的检疫把关技术能力，保障口岸生物安全。

1 材料与方法

1.1试验材料

pUC-LSDV重组质粒，参考LSDV国际参考株-南非Neethling-OBP疫苗毒株（Genbank:KX764645.1）序列，选择病毒附着蛋白编码基因序列进行人工合成，插入克隆载体中。筛选阳性克隆，抽提质粒，命名为pUC-LSDV，中国检科院实验室保存。

1.2 主要试剂

PCR试剂盒购自TaKaLa，牛乳购自伊利公司。

1.3检测方法和引物

  应用的检测方法为OIE（2016）2.04.13章1.5节《牛结节性皮肤病病毒核酸PCR检测方法》，具体引物序列如表1。

表1  能力验证样品制备所用检测方法引物

1.4 能力验证样品的制备

将质粒pUC-LSDV进行10倍梯度稀释，然后按照比例掺入健康牛乳进行混合处理，根据PCR方法结果选高、低浓度的的模拟样品，作为能力验证的阳性样品。阴性样品为健康牛乳。所有的样品均分装于2 毫升的冻存管中，真空冻干仪（德国CHRIS，型号ALPHA 1-2LD PLUS）冻干，-20℃保存。

1.5能力验证样品的检验

1.5.1均匀性检验

随机从-20℃保存的分装好的样品中各抽取10份，编号后采用OIE推荐《牛结节性皮肤病核酸PCR检测方法》提取核酸进行PCR检测，每个样品重复检验3次。

1.5.2稳定性检验

鉴于能力验证样品采用快递方式进行寄送。除了特殊气候以及特殊情况，正常情况下，样品2～4d左右到达国内参试实验室。考虑到样品寄送温度和时间，对样品实际运输、保存条件进行模拟，开展稳定性试验。

随机抽取均匀性测定后的分装样品（阳性和阴性）各24支，每6份一组，分别储存于：恒温培养箱（37℃）、常温、冰箱冷藏（2℃～8℃）及低温（-20℃），按照“发样前1d、发样后4d、发样后20d”时间点进行样品稳定性检测。样品分别采用OIE推荐《牛结节性皮肤病核酸PCR检测方法》进行检测，每个样品重复检验3次进行检测，观察样品的稳定性。测试过程中所依据的标准、所用试剂、测试条件、操作人员等与均匀性测试时相同。

1.6 能力验证的实施

1.6.1组织形式　

本次能力验证是2017年国家认证认可监督管理委员会组织的A类能力验证计划之一，由中国检验检疫科学研究院动物检疫实验室负责具体实施。能力验证样品通过快递的方式统一下发给参试实验室，每个实验室随机发放４个样品，其中包括强阳、弱阳和阴性样品至少1份，不指定检测方法、检测试剂；参试实验室根据实际情况选择不同方法和检测试剂，以客观反映实验室LSDV核酸检测的真实状态，检测完毕结果报验证单位审核评价。

1.6.2 参试实验室及检测方法

参试实验室本着“项目检测评价及业务需求”原则进行报名。此次能力验证采取发放检测样本、自主检测的方式进行，可采用OIE推荐方法、实验室自建方法或商品化检测试剂盒进行检测。

1.6.3能力验证结果评价

本次能力验证评价方法采用定性检测判定，仅以“核酸阴阳性”进行结果统计（PCR产物核酸电泳参数与序列BLAST分析参数结合，综合判定为阳性“+”或者阴性“-”），用于对参试实验室测试结果的判定。具体判定依据： 

①琼脂糖凝胶电泳：有可见目的条带且大小相符，初步判为核酸阳性，再依据目的条带亮度的强弱，界定产物含量的多少；琼脂糖凝胶电泳无可见目的条带，终判为核酸阴性。

②测序比对：核酸电泳初判为核酸阳性的样品，需进一步基因测序，将测序结果BLAST分析，若分析结果指向为牛结节性皮肤病毒株，则终判为核酸阳性。若分析结果指向非牛结节性皮肤病毒株，判为核酸阴性。

本次能力验证测试样品整体采取随机分组发放方式，但并不告其组检测目标。将参试实验室的检测结果与样品定性判定结果进行一致性比较，如4份样品均与指定结果一致则判定为“满意”，否则为“不满意”。

2结果

2.1能力验证样品的制备及鉴定

不同能力验证样品抽提DNA后，采用OIE推荐方法进行PCR检测。琼脂糖电泳结果表明，依据条带大小以及亮度，可以判定样品核酸特性与预期结果一致。阳性质粒测序结果NCBI在线BLAST分析结果表明，该序列比对结果第一指向毒株为牛结节性皮肤病毒株（Evros/GR/15）（见图2）；与国际参考毒株南非Neethling-OBP毒株（Genbank:KX764645.1）比对结果如下，匹配度为99%，是由“65149位A-G”“65006位C-T”突变造成（见图3），不会影响该样品作为检测结果的判定。

图1 能力验证样品RT-PCR检测结果

M.DL2000 DNA Marker;1.弱阳性样品；2.强阳性样品；3～4.阴性样品

图2 阳性质粒测序结果NCBI在线BLAST分析

图3 阳性质粒测序结果与国际参考毒株比对结果

2.2均匀性检测

随机抽检阴性样品或阳性样品，采用推荐方法进行检测，均与预期结果相同，具有良好的均匀性。

表2 LSDV核酸样品均匀性检测结果

备注：“+”代表核酸阳性，“-”代表核酸阴性

图4 LSDV核酸阴性样品均匀性检测结果

M.DL2000 DNA Marker;1～10.阴性样品

图5 LSDV核酸阳性样品均匀性检测结果

M.DL2000 DNA Marker;1～10.阳性样品

2.3稳定性检测

随机抽取阴阳性样品，在规定保存条件下进行稳定性检验，结果表明：在37℃下存放20d，所制备的阴阳性样品可以保持良好的稳定性。样品采用快递邮寄方式，寄送至各实验室一般需要3d，最长超不过7d，因此，可以保证样品到达参试实验室保持良好的稳定性。

表 3LSDV核酸样品不同保存条件下稳定性试验结果

备注：“+”代表核酸阳性，“-”代表核酸阴性

图6 LSDV核酸阳性样品稳定性检测结果

M.DL2000 DNA Marker;1～3.阳性样品37℃发样前1d/发样后4d/ 发样后20d检测结果；4～6.阳性样品常温发样前1d/发样后4d/ 发样后20d检测结果；7～9.阳性样品2℃～8℃发样前1d/发样后4d/ 发样后20d检测结果；10～12.阳性样品-20℃发样前1d/发样后4d/ 发样后20d检测结果。

图7 LSDV核酸阴性样品稳定性检测结果

M.DL2000 DNA Marker;1～3.阴性样品37℃发样前1d/发样后4d/ 发样后20d检测结果；4～6.阴性样品常温发样前1d/发样后4d/ 发样后20d检测结果；7～9.阴性样品2℃～8℃发样前1d/发样后4d/ 发样后20d检测结果；10～12.阴性样品-20℃发样前1d/发样后4d/ 发样后20d检测结果。

2.4参试实验室及参试方法

本次能力验证项目主要来自20个省（直辖市及自治区）的出入境检验检疫局技术中心（实验室）及地方出入境检验检疫局技术中心27家实验室自愿报名参加，全部实验室反馈了检测结果。具体分布见图8。

图8  参试实验室地理分布图

2.5能力验证结果评价

本次能力验证共有27家实验室报名参加，27家递交了结果报告单，27家初测结果与指定的定性判定结果一致，能力评价结果为满意，占全部实验室的100%。

本次能力验证共发放108份样品，其中108份样品的检测结果均与指定判定结果一致，一致程度达到100%。

表4  参试检测样品检测结果统计分析

图9 参试实验室检测结果及评价结果

3讨论

3.1不同检测方法的差异

27家实验室均采用了OIE推荐方法，但具体选择的检测试剂不完全一致。

   具体检测方法不同，所选择的核酸制备与PCR反应体系不同，优化策略不一致，最终造成不同实验室检测结果数值稍有偏差。考虑PCR产物采用核酸电泳检测，电泳检测几乎不能区分样品浓度的高低。主要原因：核酸检测过程（核酸提取、核酸扩增以及电泳检测）不同试剂的差异造成“电泳肉眼观察区分不出PCR产物产量的高低，但未影响核酸阴阳性的最终判定，只要可能满足低浓度样品且测序指向LSDV，即视为满意。

3.2检测盲样的选择

鉴于牛结节性皮肤病为外来病，缺乏相关真实感染背景阳性材料，本次验证采用了模拟样品，选择“质粒与健康牛产品”进行比例混合，既满足了核酸提取环节和PCR扩增检测环节质控需求，又保障了实验室生物安全。为了满足样品运输和保存需求，本次验证采用“抽真空冻干”方式对样品进行了处理，极大提高了样品稳定性，也有效规避了液体样品难以寄送的难题。

     本次能力验证参试实验室涉及全国东西南北20个省、直辖市、自治区，运输环境复杂，运输距离长短不同，并且样品的运输定在8月份、9月份(有的地区环境温度高达40℃)，昼夜温差大。虽然环境复杂多样，但就检测结果的情况来看，盲样本身受环境影响差异不大。

3.3检测设备的选择

本次能力验证中，PCR仪器型号多样。虽然不同实验室选择的仪器不同，但并不影响各实验室对检测盲样的结果判定。因此，针对各实验室检测牛结节性皮肤病核酸，检测结果判定不会受PCR仪器的影响。

3.4建议

本次能力验证涉及“核酸抽提”以及“核酸扩增检测”2个阶段。参试实验室无商品化检疫试剂盒选择，均采用不同的检测方法进行，虽然不会影响最终的判定结果，但检疫技术的规范化和标准化推广将会受到很大制约。建议及时跟进标准或法规，研发和推广相应的检测试剂盒。

参考文献：

[1]OIE.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals(2018):Chapter 2.4.13 Lumpy Skin Disease.

[2] 农业部、国家质量监督检验检疫总局.中华人民共和国进境动物检疫疫病名录:联合公告第2013号[EB/OL]. 2017.

http://www.aqsiq.gov.cn/xxgk_13386/ywxx/dzwjy/201312/t20131205_390094.htm.

[3]Casal J,Allepuz A,Miteva A,etal. Economic cost of lumpy skin disease outbreaks in three Balkan countries:Albania,Bulgaria and the Former Yugoslav Republic of Macedonia (2016-2017)[J].Transbound Emerg Dis. 2018,10.

[4]Saegerman C,Bertagnoli S,Meyer G,etal.Risk of introduction of lumpy skin disease in France by the import of vectors in animal trucks