补肾温阳、祛风散寒法对肾阳虚围绝经期模型大鼠卵巢PI3K/AKT/mTOR蛋白表达的影响^&

曹俊岩¹ 张帆² 王菁¹ 张鑫¹  易旭¹

（1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550001；2.贵阳中医学院第二附属医院，贵州省贵阳市飞山街32号 550001）

[摘要]目的：探讨肾阳虚围绝经期模型大鼠在自拟更年汤不同剂量干预下对卵巢PI3K/AKT/mTOR蛋白表达的影响。方法：选24只4～6月龄的青年大鼠作为对照组，构建肾阳虚模型。另采集阴道脱落细胞将10～12月龄雌性SD大鼠筛选出围绝经期模型，并将该模型大鼠随机分为模型组、利维爱组、更年汤低、中及高剂量共5组，每组24只。以上6组均给予相应药物灌胃，末次给药24小时后，检测卵巢组织中IGF-1、IGF-1R及PI3K/AKT/mTOR蛋白表达。结果：更年汤高剂量组、西药组IGF-1、IGF-1R及PI3K/AKT/mTOR蛋白表达均较高，与模型组比较均有显著性差异(P<0.05)。结论：更年汤能改善肾阳虚型围绝经期模型大鼠卵巢组织中PI3K/AKT/mTOR蛋白表达，可能与能调节IGF-1及其受体的表达量有关。

[关键词] 更年汤；模型大鼠；IGF-1；IGF-1R；PI3K/AKT/mTOR蛋白

Influence of Reinforcing  Kidney and warming Yang, dispelling Wind and Cold Method on Expression of PI3K/AKT/mTOR Protein in Ovary of Perimenopause Rats With Kidney-Yang Deficiency

Cao Junyan，Zhang Fan，Zhang Xin，Wang Jing，Yi Xu

（1. Guiyang College of traditional Chinese Medicine, Guizhou Guiyang 550001, China，2.Affiliated Hospital of Guiyang College of traditional Chinese Medicine, 550001, 23 Feishan Street, Guiyang City, Guizhou Province）

Abstract: Objective:To study the effect of Gannian decoction on expression of PI3K/AKT/mTOR protein in ovary of perimenopause rats with kidney-yang deficiency. Methods:24 young rats of 4~6 months old were selected as control group,constructing Kidney-Yang deficiency Model.Female SD rats aged 10 to 12 months were selected to collect vaginal exfoliated cells to screen peri-menopausal model rats.The peri-menopausal model rats were randomly divided into three groups: the low dose group, the middle dose group, the high dose group and the Levi group with 24 rats in each group.After the model was successfully constructed, the corresponding drugs were given orally. After the last administration 24 hours,detecting the expression of IGF-1 and its receptor protein，PI3K/AKT/mTOR protein in

ovarian tissue.Results：Gannian soup could improve the expression of PI3K/AKT/mTOR protein in the ovarian tissue of rats with kidney-yang deficiency, which might be

related to the regulation of the expression of IGF-1 and its receptors. 

Keywords:Gannian soup, Peri-menopausal model of kidney-yang deficiency in rats,IGF-1,IGF-1R，PI3K/AKT/mTOR

目前全球进入老龄化时代，老年女性的身心健康成为社会极为关注的问题，故绝经综合征研究成为热点之一。中医药治疗此病时长期用于临床，并且疗效明确、安全性高、副作用少、无用药禁忌。前期研究显示^［1-4］自拟更年汤具有类雌激素样作用，治疗肾阳虚型及肾阴阳两虚绝经前后诸症临床疗效明确，同时抑制肾阳虚围绝经期模型大鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子，从而促进颗粒细胞发育，对改善卵巢功能有一定药理作用。本课题在此基础上以该信号通路为切入点，探讨自拟更年汤是否通过调节肾阳虚围绝经期模型大鼠卵巢中PI3K/Akt/mTOR信号通路对卵泡的影响，进而影响卵巢功能。

1 实验材料及方法

1.1实验动物 SD雌性大鼠，清洁级，4月龄30只，体重250±30g，10-12月龄170只，体重300±30g。第三军医大学医学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK2012-0003。大鼠进购后适应性喂养1周，喂养期间光照、黑暗各12小时，自由饮水，摄食颗粒饲料，室温18-22℃，湿度68~70%。

1.2实验药品

1.2.1自拟更年汤 熟地12g 山药12g 枣皮12g 仙茅12g 仙灵脾12g巴戟天12g 女贞子12g桑寄生12g 旱莲草12g 当归10g 独活9g 防风9g 桂枝9g 细辛3g 炙甘草6g，以上中药是由贵阳中医学院第二附属医院中药药房所提供。每次用前按相关药物浓度比例煎制后储存于4℃冰箱。

1.2.2其他实验药品 生理盐水，规格：250ml/2.25g，贵州科伦药业有限公司，批准文号：国药准字号：H20033939。氢化可的松注射，规格：10mg×2ml×10支，华中药业股份有限公司，批号：国药准字H42021507。利维爱（替勃龙片），规格：2.5mg×7s×12，N.V.Organon公司，批准文号：H20120471。

1.3主要实验试剂及器材 苏木素染液，北京博奥森生物技术有限公司生产，生产批号：140315；伊红染液，北京博奥森生物技术有限公司生产，生产批号：140315；大鼠免疫组化检测试剂盒，基因科技（上海）股份有限公司，生产批号：2017060903；大鼠免疫组化抗原修缓冲修复液，基因科技（上海）股份有限公司提供，生产批号：2017080301。大鼠胰岛素生长因子1（IGF-1）免疫荧光试剂盒，生产批号：ab106836，艾搏抗（上海）贸易有限公司提供；大鼠胰岛素生长因子1受体（IGF-1R）免疫荧光试剂盒，生产批号：ab182408，艾搏抗（上海）贸易有限公司提供。1510型酶标仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）、TDZ4-WS医用离心机（湖南平凡科技有限公司）、莱卡DM300显微镜（德国莱卡公司）、奥林巴斯倒置荧光显微镜IX71（日本奥林巴斯株式会社）、101-2AB型干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、电热恒温水浴箱（天津市泰斯特仪器有限公司），以上仪器均由贵阳中医学院第二附属医院中心试验室提供。

1.4 动物造模

1.4.1围绝经期模型大鼠制备 采集每只SD大鼠的阴道脱落细胞进行涂片，经HE染色后在显微镜下观察。连续观察四个动情周期，共20天。若涂片底层细胞均在50%以上，为动情周期紊乱、动情间期延长，提示所观察的大鼠符合围绝经期模型的标准^[5]。将符合标准的149只围绝经期大鼠随机分为五组，每组24只，剩余剔除备用。

1.4.2肾阳虚围绝经期模型大鼠制备 围绝经期模型大鼠制备成功后，参考文献^[6-8]采用氢化可的松注射液进行肾阳虚围绝经期模型大鼠制备，按照中医脏腑辨证标准，外源性氢化可的松造成动物外观的病态表现，符合中医肾阳虚证的临床表现。将围绝经期模型大鼠于臀部肌肉丰厚处消毒后，左右交替，肌注氢化可的松注射液5mg/（kg·d）^[9-10]，连续9天，给药前后测量体重。当大鼠出现持续性萎靡不振，竖毛，脱毛，毛不光洁，拱背少动，反应迟钝、扎堆，即为肾阳虚大鼠模型造模成功。

1.5 分组和给药方法 将肾阳虚围绝经期模型大鼠随机分为5组，分别为自拟更年汤高剂量组、自拟更年汤中剂量组、自拟更年汤低剂量组、替勃龙组、模型组，加上4月龄大鼠为青年组，共6组。每日准时给模型大鼠灌胃，给药剂量按人与动物体表面积换算^[20]，换算后自拟更年汤高、中、低剂量组给药剂量分别为26.4g/（kg·d），13.2g/（kg·d），6.6g/（kg·d），替勃龙组为0.22mg/（kg·d），模型组及青年组给予1ml/100g生理盐水灌胃，连续15日。

1.6 标本采集 因动物之间的相互撕咬以及实验过程不耐受导致死亡。采集标本时，大鼠总数为97只，自拟更年汤高、中、低剂量组各为13只、17只、14只，替勃龙组18只，模型组14只，青年组21只。末次给药后禁食24小时后，称重，10%水合氯醛0.4ml/100g腹腔注射麻醉^[11-13]，麻醉生效后，消毒，暴露双侧股动脉，采血，脱颈处死，打开腹腔，摘取双侧卵巢，去除其周围多余脂肪组织，双侧卵巢组织随机一侧用10%中性甲醛溶液固定，4℃冰箱保存，另一侧分为2部分，分别装入无RNase离心管，立即存于-80℃冰箱中，以上操作均在无菌操作台完成。

1.7 检测方法

1.7.1大鼠卵巢组织上IGF-1及受体蛋白表达 采用免疫荧光方法：①将切好的冰冻切片从-20℃取出置于室温晾干15～30分钟。②用标记笔做好样本的标记，用实验油笔将需染组织画圈避免染色不均，范围约为0.5～1cm，再用磷酸缓冲液（PBS）覆盖组织清洗3次，每次3分钟。③洗后用枪头吸去或甩干组织周围多余液体并放于保湿盒内，每张玻片滴加配制好的10%山羊血清50ul～100ul覆盖组织，将保湿盒放于37℃的孵育盒中孵育1小时。④孵育好的组织用PBS清洗2次，每次3分钟，洗好后吸去组织周围多余的液体，滴加加配制好的IGF-I及IGF-IR一抗工作液50-100ul覆盖组织（比例均为1：200），再次放于湿温盒内，并将湿温盒放于4℃冰箱过夜。⑤次日将过夜的组织切片置于孵育箱内37℃孵育1小时，孵育好后PBS清洗3次，每次3分钟。⑥滴加配制好的二抗工作液 50～100ul覆盖组织（比例1:200），滴加好后放于37℃孵育箱孵育2小时，孵育好后用PBS清洗3次，每次3min（避光洗）。⑦洗净后滴加DAPI染液 50～100ul将组织覆盖，将保湿盒放于孵育盒中避光染色5～10min，染色好后PBS清洗3次，每次3分钟，后吸去或甩干多余液体用抗荧光减弱胶封片。⑧将切片放于荧光显微镜下观察所需观察指标在卵巢组织中的定位表达并拍照。

图片分析方法：免疫组化及荧光结果均用此方法分析，所拍下的图片经Image-pro plus 6.0(图像处理软件）进行分析，通过卵巢组织上所需观察指标的阳性表达的强度，最终经软件计算后换算成平均OD（吸光度）值。

1.7.2免疫荧光检测卵巢PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达测定

免疫荧光检测操作步骤 ①将储存于-80℃一部分卵巢组织取出，OCT包埋组织，置于冰冻切片机上进行切片（由贵阳中医学院第二附属医院病理科协助），厚约4μm，室温晾干。②用免疫组化油笔将需染组织圈好，标记，PBS清洗，2min×3次，除OCT。③10％正常山羊血清室温封闭1小时，后轻轻吸干封闭液。④滴入1:200稀释的一抗工作液，均匀覆盖组织面，放入湿盒内，4℃孵育过夜。⑤第二天，将切片置于37℃恒温水箱中复温1小时，PBS清洗2min×3次。⑥滴加1:200稀释的二抗工作液，37℃孵育2小时，PBS清洗2min×3次，避光。⑦滴加Hoechst 33342染液作细胞核液染，室温，避光，孵育5min。⑧吸去细胞核液染，滴加适量防荧光衰灭封片剂，缓慢盖上盖玻片。⑨倒置荧光显微镜下观察细胞及它们在组织中的定位，选取具有代表性的区域并拍照。

免疫荧光数据采集 PI3K、p-Akt、p-mTOR免疫荧光表达随机选择100倍3个视野，图片采集后采用Image-Pro Plus 6.0计算机图像系统分析，读取所选区域的平均积分光密度（IOD）。

2 数据统计 数据统计采用SPSS21.0软件，计算各组平均值`x和标准差s，表示为`x±s，符合正态分布，组内采用Paired t test；多组间比较采用One-way ANOVA，方差齐时，两组间比较用independent-samples t test分析，组间比较采用LSD和S-N-K分析，方差不齐时采用Tamhane’s T2检验；对于不服从正态分布的资料，采用Wilcoxon rank sum test。P＜0.05为差异具有统计学意义，P＜0.01为差异具有显著统计学意义。

3 结果

3.1各组大鼠卵巢组织中IGF-1及其受体表达结果 造模后大鼠卵巢组织中IGF-1及其受体表达明显低于正常青年组（P<0.01）；经药物干预后，更年汤高剂量组、西药组大鼠卵巢组织上IGF-1及其受体表达明显得到增加（P<0.01）；更年汤中剂量也能增加模型大鼠卵巢组织上IGF-1R表达（P<0.05）；低剂量组则作用不大（P>0.05）。见表1，图1，2。

表1 各组大鼠卵巢组织中IGF-1及IGF-1R表达结果比较（`x±s）

注：单因素方差分析P＜0.01。经LSD检验，与模型比较*P>0.05，◇P＜0.05，■P＜0.01。与低剂量比较#P>0.05，▲P＜0.01；与中剂量组比较★P＜0.01，◇P>0.05；与高剂量组比较▼P＜0.01，○P>0.05；与替勃龙组比较※P＜0.01。

  1-1                      1-2                       1-3

1-4                      1-5                        1-6

    图1各组大鼠卵巢组织上IGF-1的免疫荧光图片（200×）

图注：1-1青年组，表达较强；1-2替勃龙组，表达强；1-3高剂量组，表达强；1-4中剂量组，表达中度；1-5低剂量组，表达弱。1-6模型组组，表达较弱。

2-1                       2-2                        2-3

2-4                       2-5                        2-6

图2各组大鼠卵巢组织上IGF-1R的免疫荧光图片（200×）

图注：2-1青年组，表达较强；2-2替勃龙组，表达强；2-3高剂量组，表达强；2-4中剂量组，表达中度；2-5低剂量组，表达弱。2-6模型组组，表达较弱。

3.2免疫荧光检测卵巢PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量

3.2.1卵巢PI3K蛋白表达量 各组大鼠卵巢PI3K蛋白表达量比较，①自拟更年汤高、中、低剂量组，替勃龙组，模型组与青年组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。②自拟更年汤高剂量组及替勃龙组与模型组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；虽然自拟更年汤中、低剂量组的表达水平稍高于模型组，但其三者差异无统计学意义（P＞0.05）。③自拟更年汤高、中剂量组与替勃龙组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；自拟更年汤低剂量组与替勃龙组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。④自拟更年汤中剂量组与自拟更年汤高剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；自拟更年汤低剂量组与自拟更年汤高剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。⑤自拟更年汤低剂量组与自拟更年汤中剂量组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2，图3，4。

表2 各组大鼠卵巢PI3K蛋白表达量（`x±s）

注：采用One-way ANOVA。与青年组比较，^☆P＜0.01。与模型组比较，^○P＜0.01，

^※P＞0.05。与替勃龙组比较，^△P＜0.01，^〼P＞0.05。与自拟更年汤高剂量组比较，^■P＜0.05，^◇P＞0.05。与自拟更年汤中剂量组比较，^☒P＞0.05。

3.2.2卵巢p-Akt蛋白表达量 各组大鼠卵巢p-Akt蛋白表达量比较，①自拟更年汤高剂量组及替勃龙组与青年组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；自拟更年汤中、低剂量组及模型组与青年组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。②替勃龙组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；自拟更年汤高剂量组与模型组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.05）；虽然自拟更年汤中、低剂量组的表达水平稍高于模型组，但三者差异无统计学意义（P＞0.05）。③自拟更年汤各剂量组及替勃龙组两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3，图5,6。

表3 各组大鼠卵巢p-Akt蛋白表达量（`x±s）

注：采用Tamhane’s T2检验。与青年组比较，^☆P＜0.01，^★P＜0.05。与模型组比较，^○P＜0.01，^●P＜0.05，^※P＞0.05。

3.2.3卵巢p-mTOR蛋白表达量 各组大鼠卵巢p-mTOR蛋白表达量比较，①自拟更年汤高剂量组及替勃龙组与青年组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。②自拟更年汤中、低剂量组及模型组与青年组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。③替勃龙与模型组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；自拟更年汤高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；虽然自拟更年汤中、低剂量组的表达水平稍高于模型组，但三者差异无统计学意义（P＞0.05）。④自拟更年汤各剂量组及替勃龙组两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4，图7,8。

表4 各组大鼠卵巢p-mTOR蛋白表达量（`x±s）

组别	n	p-mTOR
自拟更年汤低剂量组	14	9.79±3.99☆※
自拟更年汤中剂量组	17	12.69±4.73☆※
自拟更年汤高剂量组	12	17.49±8.21★●
替勃龙组	18	16.94±7.35★○
模型组	14	8.11±4.10 备案信息 举报中心 举报中心 行业协会 网络110 互联网协会 举报热线 首都协会 本站持《出版物经营许可证》 仅从事《中国陶瓷》杂志的网上订阅工作,非任何杂志官网,并不涉及杂志社的出版等事务,特此声明！ 工信部备案：湘ICP备2025122662号-1，营业执照统一社会信用代码：91430721MAEHMRR7OE， 出版物经营许可证号：新安新出发证字第2025002号 特别声明:本站资料均源于网上的共享期刊资源，请特别注意，勿做其他非法用途。 如有侵犯您的版权或其他有损您利益的行为，请联系指出，期刊咨询服务平台会立即进行改正或删除相关内容! 扫码添加微信咨询 QQ客服：1663286777 电话：137-1883-9017 收到信息将及时回复