老鹳草素对D-氨基半乳糖诱导的肝损伤小鼠的保护作用及机制研究

李家妮¹，李梓萌¹，高雅¹，钟明利¹，曹秋妍¹，郭丹¹，张可锋^1,2*

（¹桂林医学院，广西 桂林 541004；²甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

［摘要］  目的:研究老鹳草素对D-氨基半乳糖（D-GalN）致急性肝损伤小鼠的保护作用及机制。方法：60只小鼠随机分为正常组，模型组，水飞蓟素组（阳性组，180 mg·kg^-1）、老鹳草素低、中、高剂量组（50，100，200 mg·kg^-1），灌胃给药每天1次，正常组及模型组小鼠灌胃生理盐水连续10天。末次给药2 h后，除正常组外，其余各组腹腔注射D-GalN（500 mg·kg^-1），建立D-GalN致小鼠急性肝损伤模型。16 h后，收集血清和肝组织。生化法测定血清中ALT、AST、ALP、TBIL和肝脏中MDA、T-SOD、GSH-Px活性或含量；ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ含量；Western-blot分析肝组织中TLR-4和NF-κB蛋白表达情况；HE染色观察肝组织病理学变化。结果：与模型组比较，老鹳草素能够明显降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL和肝脏MDA活性或含量（P<0.05，P<0.01），且增强肝脏T-SOD和GSH-Px活性（P<0.05，P<0.01），同时抑制血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ含量的升高和TLR-4、NF-κB的蛋白表达（P<0.05，P<0.01）；HE染色结果显示其对肝组织损伤程度有明显改善作用。结论：综上所述，老鹳草素对D-GalN诱导的急性肝损伤小鼠具有显著的保护作用，其保肝作用机制可能与抑制氧化应激、炎症反应以及TLR-4/NF-κB信号通路有关。

[关键词]  老鹳草素；急性肝损伤；氧化应激；炎症反应；TLR-4/NF-κB信号通路

Protective Effects and Mechanisms of Geraniin on D-galactosamine-induced Liver Injury in Mice

LI Jia-ni¹, LI Zi-meng¹, GAO Ya¹, ZHONG Ming-li¹, CAO Qiu-yan¹, GUO Dan¹, ZHANG Ke-feng^1,2*

（1. Guilin Medical University, Guilin 541004, China；

2. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China）

[Abstract]  Objective: To explore the hepatoprotective effects and its mechanism of the Geraniin on mice with acute liver injury induced by D-galactosamine (D-GalN). Methods: A total of 60 Kunming mice were randomly divided into normal group, model group, Silymarin group (positive group 180 mg·kg^-1), Geraniin-low, medium and high dose group (50,100,200 mg·kg^-1). All the mice were given by gavage once a day for 10 d with Saline or corresponding dose of drugs (10 mL·kg^-1) simultaneously. After 2 h of the last administration, except the normal group, the mice of other groups were injected intraperitoneally with D-GalN (500 mg·kg^-1) to induce the acute liver injury. 16 h later, the eye balls of mice were removed to take blood, and all mice were sacrificed to collect samples of liver. Determination activity or content of ALT, AST, ALP, TBIL in serum and MDA, T-SOD, GSH-Px in liver by biochemical method The serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), γ-interferon (IFN-γ)and interleukin-6 (IL-6) were detected by ELISA assay, and expression of TLR-4 and NF-κB proteins were detected by Western Blot. Liver histopathological changes were observed by HE staining. Results: Compared with the model group, Geraniin can reduce activities or contents of ALT, AST, ALP, TBIL in serum and MDA in liver of mice (P<0.05 or P<0.01), increase activities of T-SOD and GSH-Px in liver (P<0.05 or P<0.01), meanwhile inhibite the contents of TNF-α, IL-1β , IL-6, IFN-γ and expression of TLR-4 and NF-κB proteins in serum (P<0.05 or P<0.01). The results of HE staining showe that acute liver injury of mice was improved to different degrees obviously by Geraniin. Conclusion: In summary, Geraniin has obvious protective effective on acute liver injuries induced by D-GalN in mice. Mechanism may be connected with oxidative stress, inflammation and TLR-4/NF-κB signaling pathway.

[Key Words]  Geraniin; acute liver injury; oxidative stress; inflammatory response; toll-like receptor-4/ nuclear factor-kappa B pathway

肝脏除了作为解毒和新陈代谢的重要场所，还能够再生和修复肝细胞，并且参与调节多种生理功能^[1]。肝脏功能很强大，但也容易被某些化学因素如D-氨基半乳糖（D-GalN）、酒精和对乙酰氨基酚损伤，导致细胞坏死，影响肝脏功能的正常运作，最终威胁人体生命健康^[2]。

老鹳草素（Geraniin）是一种黄色结晶状多酚类化合物，存在于老鹳草、叶下珠、睡莲花等多种药用植物中^[3]。老鹳草属于牻牛儿苗科，其品种繁多，共有老鹳草属植物55种，分布广泛^[4]。大戟科植物叶下珠存在于我国众多省区如河北、山西、陕西、华东、华中、华南、西南等^[5]。睡莲花为睡莲科多年生水生草本植物，主产于新疆南部^[6]。研究表明老鹳草素具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性，能够清除自由基，且可抑制氧化应激水平^[3-7]。因老鹳草素有抗炎、抗氧化、抗菌等多种药理作用，所以其运用于制药、食品营养和化妆品等方面有潜在的可能性^[8]。除此之外，老鹳草素具有保肝作用^[9-10]，但具体机制尚未深入研究。本研究采用D-GalN诱导小鼠急性肝损伤模型，研究老鹳草素保肝作用机制，为老鹳草素在保肝作用方面的进一步研究提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  动物  SPF级昆明种雄性小鼠60只，体重在18~22 g之间，4周龄，由桂林医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（桂）2010-0001。饲养室温度控制为18~22 ℃，相对湿度为50％~60％。

1.2  药物与试剂  老鹳草素（Geraniin，上海源叶生物科技有限公司，批号P11A8F33736）；水飞蓟素（大连美仑生物技术有限公司，批号MB5982）；D-GalN（玛雅试剂有限公司，批号831361）；谷丙转氨酶（ALT）试剂盒，谷草转氨酶（AST）试剂盒，碱性磷酸酶（ALP）试剂盒，总胆红素（TBIL）试剂盒，总超氧化物歧化酶（T-SOD）试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒和丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20170508，20170424，20170415，20170525，20170607，20170519，20170622）；RIPA裂解液，BCA试剂盒和SDS-PAGE缓冲液（碧云天生物技术研究所，批号分别为p0008，p0012，20170722）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白介素-1β（IL-1β），白介素-6（IL-6）和γ-干扰素（IFN-γ）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为20170611，20170426，20170819，20170713）；Toll样受体-4（TLR-4）和核转录因子-κB（NF-κB）抗体（Abcam公司，批号分别为ab72506，ab59374）；β-肌动蛋白（β-actin）抗体（傲锐东源生物科技有限公司，批号6007-1-Ig）。

1.3  仪器  Epoch酶标仪（美国Bio-tek公司），LGJ-12冻干机（北京松原华兴科技发展有限公司），TGL-16K台式高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机厂），THZ-C-1台式恒温振荡器（太仓市实验设备厂），1658000型电泳仪和4530型转膜仪（美国Bio-Ｒad公司），Fluor Chem M型凝胶成像系统（美国PS公司）。

1.4  方法

1.4.1  动物分组、造模及给药  将60只小鼠随机分为6组，每组10只，分别是正常组，模型组，水飞蓟素组（阳性组，180 mg·kg^-1），老鹳草素低，中，高剂量组（50，100，200 mg·kg^-1）。正常组和模型组每天灌胃10 mL·kg^-1的生理盐水，剩余各组以同种方式和体积给与相应剂量的老鹳草素，每天1次，持续10 d。除了正常组，末次给药2 h后其余各组腹腔注射D-GalN（500 mg·kg^-1），禁食不禁水16 h后，眼眶取血，于4 ℃，4500 r·min^-1离心机中离心15 min取上清液，于-20 ℃冰箱保存。取材时选取最大的一片肝脏剪下一部分肝组织，置于4％多聚甲醛中固定，保持组织结构完整，准备制作病理切片。将剩余部位肝组织保存于液氮中，用于检测TLR-4和NF-κB蛋白的表达情况。

1.4.2  指标检测  参照标准操作步骤，生化法检测血清中存在的肝脏指标ALT、AST、ALP、TBIL和肝脏T-SOD、MDA和GSH-Px含量或活性；Western blot检测肝组织中蛋白表达情况；ELISA测定血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ含量；浸泡于4%多聚甲醛溶液室温固定24 h后，按照标准步骤脱水、包埋、切片3μm、烤片，HE染色、树胶封片等，光学显微镜下观察肝组织正常组、模型组和给药组之间病理学变化。

1.5  统计学处理方法  所有数据均在GraphPad Prism5软件进行统计，各组数据以（`x±s）表示，显著性检验首先采用单因素方差分析（ONA-WAY ANOVA），然后使用事后多重比较（Dunnett’s Multiple Comparison Test），P<0.05表示有统计学差异。

2  结果与分析

2.1  老鹳草素对D-GalN致急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响  与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT和AST活性均显著升高（P<0.01），表明小鼠急性肝损伤成功建模；与模型组比较，水飞蓟素组可显著降低ALT和AST活性（P<0.01），老鹳草素低剂量组可降低血清AST活性，有统计学差异（P<0.05），对ALT活性无明显改变（P>0.05），老鹳草素中剂量组和老鹳草素高剂量组均可显著降低ALT和AST活性（P<0.01），该结果表明老鹳草素具有一定的保肝作用，结果见表1。

表1  老鹳草素对D-GalN致急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响（`x ± s，n=10）

Table 1  Effect of Geraniin on serum transaminase activity in mice with acute liver injury induced by D-GalN（`x ± s，n=10）

注：与正常组比较¹⁾P <0.01；与模型组比较²⁾P < 0.05，³⁾P <0.01（表2、3、4、5同）。

2.2  老鹳草素对D-GalN致急性肝损伤小鼠血清ALP和TBIL的影响  与正常组比较，统计数据表明模型组小鼠血清中ALP和TBIL含量均显著增加（P<0.01），说明在D-GalN的作用下小鼠肝脏受损明显；与模型组比较，水飞蓟素组能够显著降低ALP和TBIL含量（P<0.01），老鹳草素低剂量组能降低血清TBIL含量，差异有统计学意义（P<0.05），对血清中ALP含量无差异（P>0.05），老鹳草素高剂量组和老鹳草素中剂量组能够显著降低ALP和TBIL含量（P<0.01）该结果进一步说明老鹳草素对D-GalN致急性肝损伤小鼠具有保护作用，结果见表2。

表2  老鹳草素对D-GalN致急性肝损伤小鼠血清ALP和TBIL的影响（`x ± s，n=10）

Table 2  Effect of Geraniin on serum ALP and TBIL in mice with acute liver injury induced by D-GalN（`x ± s，n=10）

2.3  老鹳草素对D-GalN致急性肝损伤小鼠肝脏T-SOD，GSH-Px和MDA的影响  与正常组比较，统计数据表明，模型组T-SOD和GSH-Px活性均显著下降（P<0.01），而MDA含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，水飞蓟素组可显著增强T-SOD和GSH-Px活性（P<0.01），且显著降低MDA含量（P<0.01），老鹳草素低剂量组升高T-SOD，GSH-Px活性，有统计学差异（P<0.05），对MDA含量无差异（P>0.05），老鹳草素中剂量组和老鹳草素高剂量组可显著增强T-SOD和GSH-Px活性（P<0.01），且显著降低MDA含量（P<0.01），该结果提示老鹳草素可能通过抑制氧化应激水平发挥保肝作用，结果见表3。

表3  老鹳草素对D-GalN致急性肝损伤小鼠肝脏T-SOD、GSH-Px和MDA的影响（`x ± s，n=10）

Table 3  Effects of Geraniin on liver T-SOD, GSH-Px and MDA in mice with acute liver injury induced by D-GalN（`x ± s，n=10）

2.4  老鹳草素对D-GalN致急性肝损伤小鼠血清TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ的影响  对与正常组比较，模型组小鼠血清TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ含量均明显增加（P<0.01）；与模型组比较，水飞蓟素组可显著抑制TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ水平（P<0.01），老鹳草素低剂量对降低IL-1β含量有统计学意义（P<0.05），老鹳草素高剂量组可显著抑制TNF-α，IL-1β，IL-6和IFN-γ水平（P<0.01），该结果表明老鹳草素可能通过抑制炎症反应起到保肝作用，结果见表4。

表4  老鹳草素对D-GalN致急性肝损伤小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的影响（`x ± s，n=10）

Table 4  Effects of Geraniin on serum TNF-α, IL-1β, IL-6 and IFN-γ in mice with acute liver injury induced by D-GalN（`x ± s，n=10）

组别	剂量(mg·kg-1)		TNF-α (ng·mL-1)	IL-1β (pg·mL-1)	IL-6 (pg·mL-1)	IFN-γ (pg·mL-1)
正常组	—	153.49±20.16		126.38±15.54	83.24±11.65	72.16±9.60
模型组	—	365.45±46.281)		364.49±46.181)	194.01±25.191)	216.33±24.391)
水飞蓟素组	180	286.14±32.163)		263.08±30.533)	163.47±18.323)	199.34±26.61
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