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水翁花对内毒素致休克小鼠血清中NO和TNF-α含量的研究罗清¹ 戴卫波谢建文高玉桥胡莹

（广州中医药大学附属中山医院广东中山 528401）

摘要：目的通过水翁花对内毒素致休克小鼠血清中NO和TNF-α含量的研究，探索其抗内毒素休克的作用。方法通过注射内毒素致小鼠休克，观察水翁花对动物的休克死亡率、血清中TNF-α和NO含量的影响。结果水翁花水提液31g.kg^-1、16g.kg^-1剂量，能显著减少动物的休克死亡率，分别为10%和20%（P<0.05或0.01），能显著降低内毒素休克小鼠血清中NO和TNF-α的含量（P<0.05或0.01）。结论水翁花可通过减少内毒素致小鼠休克死亡率，降低血清中NO和TNF-α的含量，表现出良好的抗内毒素休克死亡作用。

关键词：水翁花；内毒素；休克死亡；NO；TNF-α

水翁花始载于《岭南采药录》，为桃金娘科水翁属植物水翁Cleistocalyx operculatus(Roxb.)Merr.et Perry的干燥幼嫩花蕾，又名水雍花、大蛇药、水翁仔、水榕花、水翁、酒翁、水榕树、水香。性寒，味苦，归脾、胃经。能清热解毒，去湿消滞。主用于夏天暑湿食滞所致的发热，咽干，口渴腹胀或呕吐泄泻^[1]。主产于广东、台湾、海南、广西、云南等省区，越南、印度、马来西亚也有分布。干燥水翁花久贮后色泽加深，苦味浓，清热作用大。水翁花在民间应用广泛，疗效确切，属于广东地产药材，夏季常作凉茶以解暑，是“清热凉茶”等中药的主要原料之一^[2]。我院制剂悦康外感凉茶就是以水翁花为主研制成的复方制剂，具有疏风解表，清热解毒之功效，远销国内及香港、澳门等地区^[3]。关于水翁花抗内毒素作用的研究尚未见报导，前期本课题组已从抗内毒素休克死亡率方面做过研究^[4]，发现效果显著，为了进一步证实水翁花抗内毒素的影响，本文同时对内毒素休克小鼠血清中NO和TNF-α的含量方面进行了研究。

1材料

1.1药品与试剂

水翁花药材由广州康圣药业有限公司提供（经中山市中医院药检室曾聪彦主任中药师鉴定为桃金娘科植物水翁Cleistocalyx rculatus(Roxb.)Merr.et Perry的干燥幼嫩花蕾）。制法：取水翁花1.0kg，加 12倍量水和8倍量水煎煮2次，每次2h，合并滤液，静置过滤，滤液浓缩至1000ml（1ml相当于原生药1.0g）。大肠杆菌O₅₅B₅内毒素（上海西唐生物科技有限公司）。一氧化氮试剂盒（南京建成科技有限公司）；小鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫检测试剂盒（南京建成科技有限公司）。

1.2实验动物 SPF级昆明种小鼠60只，体重18～22g，广东省医学实验动物中心提供（动物生产许可证号：SCXK（粤）2008－0020）。实验环境为广州中医药大学附属中山医院SPF级动物实验室，环境温度为18～22℃，相对湿度40～70%，动物购进后观察一周。

1.3主要仪器 UV-2550型紫外可见分光光度计（日本岛津公司），BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），Muitiskan MLB3酶标仪（热电（上海）仪器有限公司）。

2方法

2.1分组取昆明种小鼠60只，雌雄各半。随机分为6组，每组10只。①正常对照组：灌服生理盐水；②模型对照组：灌服生理盐水；③阳性对照组：地塞米松组：注射内毒素当日给药，0.02g/kg；④水翁花水提液高剂量组：31g生药/kg；⑤水翁花水提液中剂量组：16g生药/kg；⑥水翁花水提液低剂量组：8g生药/kg。各组均每天灌胃1次。

2.2模型建立 于末次给药后1.5h，除正常对照组腹腔注射等量的生理盐水外，其余各组小鼠均腹腔注射大肠杆菌O₅₅B₅内毒素60mg/kg，观察并记录各组小鼠在注射内毒素或生理盐水后3h内的形态变化和72h内的生存状况。72h后将存活小鼠断头取血，分离血清，备检一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。

2.3 检测指标

2.3.1 死亡率 小鼠在3h内的形态变化和72h内的生存状况，并计算小鼠72h的死亡率。

2.3.2 一氧化氮（NO）按照试剂盒说明书，采用硝酸还原酶法测定小鼠血清中的NO含量。

2.3.3肿瘤坏死因子（TNF-α）按照试剂盒说明书，采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠血清中的TNF-α水平。

2.4统计方法 计数资料采用Stata11.1软件，进行方差分析；计量资料采用SPSS19.0for Windows 软件处理，数据用±s表示，采用单因素方差分析，进行Dunnet-t检验。

3 结果

3.1水翁花水提液对内毒素休克小鼠生存状况及死亡率的影响

正常对照组为注射生理盐水，小鼠活动自如。药物组、模型组、地塞米松组腹腔注射内毒素1h内，小鼠均活动自如。12h后药物低剂量组、模型组有部分小鼠死亡，模型组、药物组、地塞米松组小鼠均出现耸毛、烦躁不安、颤抖、蜷缩及眼睑充血等现象，其中地塞米松组多数小鼠症状较药物组及模型组轻。注射后的第3d，药物组存活小鼠状态均有好转，模型组小鼠还是烦躁不安、颤抖、蜷缩等症状，阳性组小鼠活动自如。

模型对照组与正常对照组比较，腹腔注射内毒素所致动物死亡数有显著性差异（P< 0.01），提示此模型可用于考察水翁花水提液抗内毒素作用。水翁花水提液高、中剂量组和地塞米松组与模型组比较，对腹腔注射内毒素所致动物死亡数有显著性差异（P<0.05或0.01），其死亡率分别为10%、20%、0%。

表1 水翁花水提液对内毒素休克小鼠死亡率的影响

组别	动物数（只）	死亡数（只）	死亡率（%）
正常对照组	10	0^**	0
模型组	10	7	70
高剂量组	10	1^**	10
中剂量组	10	2^*	20
低剂量组	10	3	30
地塞米松组	10	0^**	0

注：与模型组比较，^*P<0.05, ^*^*P<0.01。

3.2水翁花水提液对内毒素休克小鼠血清中NO产生的影响

表2 水翁花水提液对内毒素休克小鼠血清中NO产生的影响

组别	动物数（只）	NO含量（μmol/L）
正常对照组	10	65.1±7.5
模型组	3	123.8±8.0^△△
高剂量组	9	66.8±14.8^**
中剂量组	8	75.9±7.1^*
水翁花低剂量组	7	118.2±6.9
地塞米松组	10	67.3±10.6^**

注：与正常对照组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05, ^*^*P<0.01。

由表2可知，内毒素休克模型组小鼠的血清NO含量与正常对照组的血清NO含量有非常显著的统计学意义（P<0.01），而水翁花水提物高剂量组、中剂量组小鼠的血清NO含量比模型组小鼠的血清NO含量有所下降，均有显著的统计学意义（分别为P<0.01或P<0.05），低剂量组与模型组比较无显著性差异。

3.3水翁花水提液对内毒素休克小鼠血清中TNF-α产生的影响

表3 水翁花水提液对内毒素休克小鼠血清中TNF-α产生的影响

组别	动物数（只）	TNF-α含量（ng/L）
正常对照组	10	69.9±7.9
模型组	3	151.3±9.6^△△
高剂量组	9	106.1±8.5^**
中剂量组	8	121.6.9±7.1^*
水翁花低剂量组	7	146.5±7.3
地塞米松组	10	95.9±5.8^**

注：与正常对照组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，^*P<0.05, ^*^*P<0.01。

由表3可知，内毒素休克模型组小鼠的血清TNF-α含量与正常对照组的血清TNF-α含量有非常显著的统计学意义（P<0.01），而水翁花水提物高剂量组、中剂量组小鼠的血清TNF-α含量比模型组小鼠的血清TNF-α含量有所下降，均有显著的统计学意义（分别为P<0.01或P<0.05），低剂量组与模型组比较，无显著性差异。

4讨论

内毒素(endotoxin，ET)是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的组成成分，细菌死亡后细胞壁裂解后释放。内毒素主要成分为脂多糖(1ipopolysaccharide， LPS)，是细菌致病的主要物质，在多种危急重症中起着重要作用，如发热反应、感染性休克、白细胞反应，多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等。内毒素还有免疫激活作用，可引起免疫损伤。近年来，已经发现许多中药具有抗内毒素作用。其作用机制有：清除或灭活内毒素，减弱或消除内毒素诱发的活性因子的损伤及对脏器组织细胞的保护作用^[⁵^]。本实验研究表明，水翁花水提液可显著减少内毒素所致动物死亡数，并能显著降低内毒素休克小鼠血清中NO和TNF-α的含量，表现出良好的抗内毒素休克死亡作用。另有研究表明，本品水提物对膜脂氧化和神经细胞氧化损伤有较好的保护作用^[⁶^]。由此提示，本品抗内毒素作用机制可能与减弱或消除内毒素诱发的活性因子的损伤及对脏器组织细胞的保护作用有关，有待于进一步研究。