环介导等温扩增技术在老年重症肺炎常见病原菌检测中的应用

肖红雯¹ 廖兴华² 彭勇 周洪伟 黄萍 余敏

（1.武汉市红十字会医院重症医学科，2.武汉科技大学，武汉 430000）

[摘要] 目的：探讨环介导等温扩增技术（loop- mediated isothermal amplification，LAMP）在老年重症肺炎病原菌早期诊断和治疗中的有效性和经济性。方法：选取2016年10月至2018年10月武汉市红十字会医院呼吸科与重症医学科老年重症肺炎患者245例，将入选病例随机分成A、B两组，两组病人分别于诊断即刻、第4d、第8d、第15d送检痰培养，A组同时对痰标本进行基于LAMP法的病原菌检测，根据检测结果指导抗生素的使用并监测疗效。B组首先进行经验性用药，根据痰培养结果进行调整。统计两组病人的临床转归、使用抗生素的费用及疗程、住院时间、多重耐药菌产生情况。结果：两组病人在临床好转率、死亡率、抗菌药物平均费用、抗菌药物使用平均疗程、住院时间上有显著统计学差异（P＜0.05），A组临床好转率(64.71%)高于B组，抗菌药物平均费用(296.24元/天)及死亡率均低于B组，抗菌药物使用平均疗程（16.2d）及住院时间（19.35d）短于B组。但两组耐药菌的检出率上未显示出显著差异。结论：基于LAMP的检测技术能提供老年重症肺炎早期病原学诊断依据并指导治疗，降低死亡率、减少抗生素使用费用及疗程、缩短住院时间，对降低多重耐药率可能有一定作用。

[关键词] 环介导等温扩增；老年重症肺炎；病原菌检测；

The loop-mediated isothermal amplification in the detection of common respiratory pathogenic bacteria in senile patients with severe pneumonia  XIAO Hongwen, LIAO xinhua. (Intensive Care Unit of Wuhan Red Cross Hospital, wuhan, 430015)

[Abstract] Objective：Explore the efficiency and economy of Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology for the early diagnosis and treatment pathogenic bacteria in senile patients with severe pneumonia. Methods: 245 elderly patients with severe pneumonia in department of respiratory medicine and intensive care unit of Wuhan Red Cross hospital from December 2016 to October 2018 were selected, and the selected cases were randomly divided into two groups, A and B. Patients in the two groups were sent to the test at the examination stage of immediately, on the 4th, 8th and 15th day of diagnosis, meanwhile, pathogens of sputum specimens in group A were detected by LAMP method, and the efficacy of antibiotics was monitored according to the test result. Group B was first treated with experimental drugs, and the root culture results were completed. The clinical outcomes(64.71%), the cost (296.24yuan /d) and course of antibiotics（16.2d）, the length of hospital stay（19.35d）, and the multiplicity of antibiotics in the two groups were statistically analyzed. Result: There were statistically significant differences between the two groups in clinical improvement rate, mortality, average cost of antibacterial drugs, average course of antibacterial drug use, and length of hospital stay (P<0.05), the clinical improvement rate of group A was higher than that of group B, the average cost and mortality of antibiotics were lower than that of group B, and the average duration of treatment and hospitalization of antibiotics were shorter than that of group B. However, there was no significant difference in the detection rate of drug-resistant bacteria between the two groups. Conclusion: The detection technology based on LAMP can provide the basis for early etiology of severe pneumonia in senile patients and guide the treatment, reduce the mortality rate, reduce the cost and treatment course of antibiotics, shorten the hospitalization time, and may play a certain role in reducing the multiple drug resistance rate.

[Keywords] Loop-mediated isothermal amplification; Senile patients with severe pneumonia; Pathogenic detection. 

老年人易罹患重症肺炎，预后常较凶险，病死率并未随着临床诊疗水平的提高和新型抗菌药物的研发而降低，据报道仍高达43％^[1]或23.1％^[2]。早期、及时、准确地应用抗生素是降低患者死亡率和改善预后的关键。细菌培养是目前临床应用最为广泛的病原学检测手段，但阳性率低、容易被污染、培养时间相对较长，存在难培养、不可培养病原菌，不能充分满足临床需要。日本学者Notomi^[4]等人于2000年发明了环介导等温扩增技术,其扩增速度快、灵敏度和特异性高^[3]，被广泛应用于核酸检测领域。恒温扩增微流控芯片核酸分析仪是利用环介导等温扩增技术特异性扩增基因片段，并利用微流控生物芯片技术自动检测，可同时检测出13种临床上常见呼吸道病原菌，并在2小时内得出检测结果，可快速、准确地指导临床抗菌药物的使用。本研究将评价基于LAMP的病原菌检测技术在指导老年重症肺炎早期病原菌诊治方面相比于传统的细菌培养有无优势及临床价值。

1 对象与方法

1.1研究对象

以中国2015年CAP指南中新的简化重症肺炎为诊断和排除标准，选择2016年10月至2018年10月武汉市红十字会医院呼吸内科和重症医学科的老年重症肺炎患者245例，其中男性155例，女性90例，年龄65~ 93岁。随机分为A组（LAMP组，n=127）、B组（培养组，n=118）。本研究排除病例：（1）入院时恶性肿瘤，免疫系统疾病，间质性肺病，全身性疾病或血液系统疾病；（2）精神异常不配合检查及记录者；对肺结核，真菌感染及非感染性疾病者高度怀疑或确诊者；（3）合并严重的基础疾病导致器官功能不全者。（4）24小时内自动出院或死亡病人、长期住院患者（住院时间1个月以上）。本研究获得我院伦理委员会批准，家属或患者签署知情同意书。

1.2 方法

（1）痰标本采集标准：白细胞数>25/低倍视野和上皮细胞<10/低倍视野，或两者比例均小于1：2.5，样本量不少于0.6ml。痰液标本通过清洁口腔后深呼吸咳嗽，或无菌吸痰管通过气管插管或气管造口抽吸，或无菌纤维支气管镜检查收集。（2）送检时间：所有标本均在诊断为重症肺炎后，使用抗菌药物前采集并送检，并在诊断后第4日、第8日复检，第15日检测有无多重耐药菌的产生， 15日内好转出院的患者不参与多重耐药菌的检测，只计入检出阳性率。标本采集后即刻送痰培养，A组同时还进行LAMP检测。（3）检测方法：培养法使用DL-96细菌测定系统进行分离，培养，药敏试验。LAMP法采用晶芯RTisochipTM-A恒温扩增微流芯片核酸分析仪及配套核酸提取和检测试剂盒（博奥生物技术有限公司，北京）进行自动检测和分析。（4）临床应用：A组根据基于LAMP技术检测结果指导抗生素的使用，并根据监测结果调整用药方案药，B组参照指南并结合本地区病原学特点进行经验性用药治疗，并根据痰培养结果调整用药方案。

1.3 观察指标

（1）临床效果指标：患者症状（咳嗽咳痰），体征（体温，呼吸频率，心率，血压，血氧饱和度）。实验室检查：肝肾功能，凝血功能，血细胞计数分类，降钙素原，C反应蛋白，转铁蛋白，氧和指数。影像学检查：胸部X线CT。

（2）患者入院后分时段采集标本，LAMP法初步检测结果判定为阴性、混合感染、阳性、强阳性。记录两组的阳性检测结果和病原菌类型。

（3）临床转归分类：

好转：临床症状、体征、实验室检查及影像学检查指标好转，痰检测转阴；维持：临床症状、体征、实验室检查及影像学检查指标好转不明显，出现新的病原菌或持续阳性为维持；恶化：临床症状、体征、实验室检查及检查影像学检查指标恶化，痰标本检测强阳性，病情恶化或死亡。

（4）记录患者使用抗生素的类型，疗程及费用，住院时间，随访治疗和预后。

1.4 统计学方法

预计A组LAMP法阳性率为70.5%，B组痰培养阳性率为57.9%，取双侧ɑ=0.05，单侧β=0.10，A组样本含量占52%，B组样本含量占48%，比较两组间阳性率是否有显著性差异需要605例样本，其中A组314例，B组291例。由于研究时间及病人数量限制，最终入选病例245例，其中A组127例，B组118例。使用 SPSS 17.0 统计软件对数据进行统计分析。计量资料以均数（x±s）表示，行t检验。Pearsonχ²检验用于比较独立计数数据，Fisher概率法用于比较不符合χ²检验的数据。P＜0.05代表差异在统计学上具有显著性。

2结果

2.1  一般情况比较

两组患者的年龄，入住科室，机械通气，社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）和医院获得性肺炎（hospital-acquired pneumonia，HAP)，合并症的分布情况无统计学差异（P>0.05）。见表1、表2。

表1 一般情况比较

   A组    127    74.88±7.41    37/90        82/45         45/82    >0.05

表2合并症分布情况

COPD              54（42.52）        48（40.68）           >0.05            

急性脑血管病       42（33.07）        40（33.90）           >0.05  

冠心病及心衰       30（23.62）        27（22.88）           >0.05

糖尿病             27（21.23）        25（21.19）           >0.05

肾脏病             20（15.75）        18（15.25）           >0.05

胸腹部外科手术     13（10.08）        11 (9.32)              >0.05

外伤               10(7.87)            9 (7.63)               >0.05

骨科手术           5 (3.94)            4 (3.39)               >0.05

2.2  LAMP法和痰培养法阳性率比较

A组标本数372份， LAMP法 262例阳性，阳性率70.43%；痰培养法217例阳性，阳性率58.33%。B组样本数332份，阳性192例，阳性率为57.83%。两种检测方法阳性率组内及组间均有显著差异（P<0.05），LAMP法阳性率高于常规培养法，见表3。

表3  LAMP和培养法阳性率比较

A组   LAMP     262        110       372     70.43%      11.86   <0.05

   培养法    217        155       372      58.33%

2.3 两组中两种检测方法对各种病原菌检出情况

LAMP法检测流感嗜血杆菌的阳性率高于培养法，有显著差异（P<0.05），提示该检测方法敏感性更高，而对其他病原菌检测情况两种方法无显著差异(P>0.05)，见表4。

表4  两组中两种检测方法病原菌检出情况比较

铜绿假单胞菌               57                  45          >0.05

肺炎克雷伯菌               45                  42          >0.05

耐甲氧西林葡萄球菌         37                  30          >0.05

肺炎链球菌                 23                  18          >0.05

金黄色葡萄球菌             25                  20          >0.05

嗜麦芽窄食假单胞菌         24                  18          >0.05

流感嗜血杆菌               33                  10          <0.05

大肠埃希氏菌               8                   5           >0.05

鲍曼不动杆菌               7                   4           >0.05

肺炎支原体                 3                

2.4 LAMP法检出病原菌分布情况

CAP以流感嗜血杆菌及肺炎链球菌、葡萄球菌为主。HAP以铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌为主，耐甲氧西林葡萄球菌比例呈上升趋势。见表5. 

表5  LAMP法检出病原菌分布情况

  铜绿假单胞菌                   6                   51

肺炎克雷伯菌                   3                   42

耐甲氧西林葡萄球菌             11                  26

肺炎链球菌                     21                  2  

金黄色葡萄球菌                 15                  10

嗜麦芽窄食假单胞菌             3                   21

流感嗜血杆菌                   33                 

大肠埃希氏菌                   1                   7

鲍曼不动杆菌                                       7      

肺炎支原体                     3                    

2.4患者临床转归，抗菌药物费用、疗程、住院时间及多重耐药菌检出情况比较

A组内死亡18例，其中10例在诊断第5~7日死亡，8例于诊断第8日后死亡，死亡当日未送检标本；B组内死亡40例，其中7例于诊断后3日内死亡，13例于诊断第5~7日死亡，20例于诊断第8日后死亡。不计死亡病例，两组平均每日使用抗生素，抗生素时间和住院时间有显著差异(P<0.05)。A组临床好转率高于B组，而死亡率低于B组(P<0.05)。不计死亡病例，两组病人住院期间平均每日使用抗菌药物费用、抗菌药物疗程及住院时间情况方面有显著差异(P<0.05)。 A组内病人每日抗菌药物费用低于B组，抗生素治疗时间和住院时间短于B组。根据诊断后第15日送检的痰培养阳性结果，对三类或三类以上抗菌药物同时耐药者为多重耐药菌（15日内出院患者不在统计范围内），由于本研究样本数量有限，纳入研究的大部分患者在15日内好转出院（或死亡），导致参与多重耐药菌检测的标本数量偏少，检出率上暂未显示出显著差异（P>0.1），如扩大样本数量继续研究，或许能得出其间的差异性。见表6及表7。

表6病人治疗结果比较

A组   82（64.56）  18（14.17）  296.24±82.83    12.07±3.96    15.27±4.27        

表7多重耐药菌检出率比较

   A组         8              42           50         16.00%

χ²=1.94，P>0.1  

3讨论

重症感染在病原菌未能明确时，推荐于1小时内使用广谱抗生素治疗^[5.6]，延迟用药可能会导致多种危害，即使给予了适当的治疗，因抗感染治疗时机延迟，也会增加医疗费用、机械通气和住院时间^[7-9]。老年重症肺炎由于患者高龄、长期卧床、营养不良、吞咽、咳嗽功能差、免疫力低下、手术等因素影响，因此往往发病隐匿，病情进展迅速，病死率高；常因合并多种基础疾患甚至器官功能障碍需要反复住院，由于大量抗生素的使用、各种侵入性导管的置入，可导致病原菌不典型，发生变迁，耐药菌及混合感染亦较常见。尽早明确病原菌并准确、及时、合理运用抗菌药物治疗显得尤其关键，同时也可以避免不合理的广覆盖或联合用药导致的耐药菌的产生。

LAMP法灵敏性高，不受抗菌药物治疗的影响^[10.11]，克服了传统痰培养法在使用抗菌药物后导致检出阳性率进一步降低的缺点。陈愉生^[12]等将LAMP法与痰培养法进行了比较，得出了LAMP法检出率明显高于培养法，与本研究结果一致。LAMP对流感嗜血杆菌敏感性高于培养法，本研究中LAMP检测到CAP中主要是流感嗜血杆菌33例，占34.38%；肺炎链球菌21例，占21.88%；HAP中主要是铜绿假单胞菌51 例，占30.72 %，与痰培养结果一致，符合当前老年肺炎的病原学统计结果^[13-15]，因此该检测方法可用于老年重症肺炎病原菌的早期诊治。

LAMP法具有快速诊断呼吸道感染性疾病的能力，有助于病原菌的针对性治疗，提高初始治疗的有效率，缩短住院时间^[16.17]。据报道重症肺炎混合感染发生率达30％~70%^[18]，本研究中混合感染结果显示为强阳性和阳性，强阳性提示为优势菌，阳性结果提示次要菌，可能需联合用药，需结合细菌的种类、临床表现及其他检查结果综合分析，决定是否联合用药，以便能快速控制感染；而痰培养主要针对优势菌群进行药敏实验，治疗上有病原菌遗漏可能。因此LAMP法能减少不必要的联合用药和广覆盖导致的耐药菌的产生，同时对混合感染能准确识别，提高早期用药的效果。本研究使用该技术直接指导早期老年重症肺炎的抗菌药物使用，并动态监测病原菌变化，评价疗效，及时调整用药，使广谱抗菌药物使用时间缩短、抗菌谱缩窄、减少错误和不必要的广覆盖、减少了联合用药，进而降低了抗菌药物的费用。由于早期准确使用抗菌药物，缩短了抗菌药物疗程，从而缩短患者住院时间，提高了临床疗效，改善了患者预后，降低了死亡率。该检测方法对减低减少耐药菌的产生可能会有一定帮助，但需扩大样本量、增加对照因素、严格入选条件等进一步研究观察其结果。由于该检测方法具有上述临床应用价值，且简单易行，适合基层医院推广并指导下呼吸道感染的治疗，可望减少抗菌药物的盲目使用及改善耐药现状。

参 考 文 献

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