糜子PmASR2基因克隆与表达分析

沈力鸿，刘思辰¹，王海岗¹，陈凌¹，王君杰¹，曹晓宁^1*，乔治军^1*

（1.山西大学生物工程学院，山西 太原030006；2.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031）

摘要：为了解糜子PmASR2基因在逆境中（干旱、NACl、糖及各种植物激素胁迫）的作用，本研究从河曲红糜子中克隆出PmASR2基因，其全长541bp，保守域长336bp，共编码112个蛋白，通过生物信息学分析可知该基因是由缺水胁迫引起的植物ABA / WDS诱导蛋白质（ASR）且为亲水蛋白，糜子PmASR2基因分别在单子叶植物和双子叶植物之间进化保守（76.4%-86.4%），其中与柳枝稷相似度最高（86.4%）。实时荧光定量PCR显示PmASR2基因在PEG、NACL、甘露醇、ABA、过氧化氢、茉莉酸甲酯、生长素、水杨酸胁迫下基因相对表达量均发生改变，并且根＞叶＞茎，其中在茎中相对表达量变化不明显。各种胁迫整体上相对表达量随时间增加呈现先升高后降低趋势，赤霉素胁迫下该基因在糜子不同部位（根、茎、叶）中相对表达量未发生太大变化。

关键词：克隆；糜子；缺水胁迫引起的植物ABA / WDS诱导蛋白质（ASR）；表达模式

中图分类号：S515   文献标识码：A   文章编号：

          Cloning and Expression Analysis of Broomcorn millePmASR2 Gene

  (1.College of Bioengineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Institute of Crop Germplasm Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Creation in the Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Excavation and Genetic Improvement of Multigrain Germplasm Resources in Shanxi Province Key Laboratory, Taiyuan 030031, China)

Abstract: In order to understand the role of broomcorn millet(Panicum miliaceum L. ) PmASR2 gene in stress (drought, Nacl, sugar and various phytohormonal stress), this study cloned PmASR2 gene from  Hequ red broomcorn millet, which is 541 bp in length and 336 bp in conserved domain.112 proteins,via bioinformatics analysis showed that the gene is a plant ABA / WDS-inducible protein (ASR) caused by water stress and is a hydrophilic protein. The broomcorn millet PmASR2 gene is evolutionarily conserved between monocots and dicots. (76.4%-86.4%), which has the highest similarity with switchgrass (86.4%). Real-time PCR showed that the relative expression of PmASR2 gene under PEG, NACL, mannitol, ABA,H2O2, MeJa, IAA and SA  were changed, and root>leaf>stem, The relative expression of stems did not change significantly. The relative expression of various stresses increased firstly and then decreased with time. Under the GA stress, the relative expression of the gene in different parts of the broomcorn milletc (root, stem, leaf) did not change much. In this experiment, the cloning and expression analysis of the PmASR2 gene of scorpion was used to further study the regulation mechanism of this gene on stress.

Key words: Cloning;  Broomcorn mille(Panicum miliaceum L. )t; Plant ABA / WDS induced protein (ASR) induced by water stress; Expression profile

干旱缺水已经成为世界农业生产面临的严重问题，由于降水量不足和降水模式发生改变，造成干旱在众多非生物胁迫中是最具有破坏性的^[1]，同时也是限制作物品质和产量一个重要因素^[2]。糜子（Panicum miliaceum L.）属禾本科黍属，又称黍、稷、糜，是干旱和半干旱主要作物^[3]。糜子生育期短，具有耐旱、耐瘠薄、干旱后复水能力强等特性，在遭受严重干旱后遇水能够快速恢复生长^[4]。同时糜子作为C4作物，在C3作物停止干物质积累的水分胁迫条件下，仍能积累干物质^[5]，是研究作物耐旱性改良的优异材料^[6]。目前科学家对抗干旱胁迫的研究主要在以下几个方面，在改良栽培方法上^[7],在植物抗旱生理方面^[8]，在分子方面^[9]。如今从抗旱作物中筛选出抗旱基因是一项研究热点。

ASR全名ABA-stress-ripening，即ABA胁迫成熟响应蛋白，1993年首次在番茄中发现能被逆境胁迫诱导^[10]目前ASR基因在谷子中已经发现7个^[11]，水稻6个^[12]，玉米中9个^[13]。Ricardi M等人研究发现在番茄中lsASR1过表达降低了烟草干旱胁迫期间水分损失率^[14]；TaASR1的过表达增加了烟草干旱胁迫的存活率^[15]。百合和香蕉中发现ASR基因能赋予拟南芥耐旱性^[16-17]；ZmASR1能够提高作物的抗旱性从而提高产量^[18]。在盐生植物亚洲落叶松中ASR1能提高转基因拟南芥对盐胁迫的耐性^[19]；OsASR1的过量表达通过增加水稻中光合作用速率提高了耐冷性^[20]；大豆ASR基因表达可以增强酵母和烟草细胞抗Cu²⁺的能力^[21]；但ASR基因在糜子的如何糜子的抗逆性和功能还未见报道，本试验通过克隆糜子ASR基因及表达分析来了解该基因赋予植物对非生物胁迫的耐受性的生理和分子机制。

1.材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为河曲红糜子，所用的克隆载体为pGM-Simple-TFast Vector（天跟生化北京科技有限公司），所用菌种DH5α购自天根生化北京科技有限公司。

1.2试验方法

1.2.1 幼苗处理

糜子种子用75%的乙醇处理2分钟，在用0.1%升汞浸泡5分钟后，用无菌水冲洗五次以上，将处理好的种子放入含有充足水分的培养皿中发芽，暗培养下使其发芽，发芽后将长势较好的幼芽放入花盆土培，在10000LXS光照16小时黑暗培养8小时条件下培养10天后，进行进行胁迫处理。

1.2.1.1 干旱胁迫处理 

将糜子幼苗放入10%PEG6000中处理水为对照，在0、1、3、6、9、12、24小时剪取糜子幼苗的根茎叶后迅速液氮冷冻，并放入-80度冰箱保存。

1.2.1.2 盐胁迫处理 

将糜子幼苗放入250mmol/LNaCl中处理水为对照，在0、1、3、6、9、12、24小时剪取糜子幼苗的根茎叶后迅速液氮冷冻，并放入-80度冰箱保存。

1.2.1.3 甘露醇糖处理 

将糜子幼苗放入200mmol/L甘露醇中处理水为对照，在0、1、3、6、12、24小时剪取糜子幼苗的根茎叶后迅速液氮冷冻，并放入-80度冰箱保存待后续试验。

1.2.1.4 激素处理 将糜子幼苗分别放入100μmol/LABA、100μmol/L茉莉酸甲酯、2mmol/L水杨酸、50μmol/L生长素、10mmol/L过氧化氢、10mg/L赤霉素中处理水为对照，在0、1、3、6、9、12、24小时剪取糜子幼苗的根茎叶后迅速液氮冷冻，并放入-80度冰箱保存。

1.2.2 植物总RNA提取

植物总RNA提取方法采用RNA提取试剂盒DP432（天根生化北京科技有限公司），提取后将RNA反转录为cDNA方法采用FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂（KR118）采购自天根生化北京科技有限公司，具体操作依照说明书进行。

1.2.3基因克隆

从NCBI中blastn水稻、谷子、玉米、柳枝稷等作物ASR家族基因，取其中遗传较为稳定的ASR基因序列来克隆，然后选取与糜子同源关系最相近的柳枝稷ASR基因EST序列为模板在NCBI里面的primer-blast设计引物，设计完成后用软件primer5.0检查该引物的特异性。扩增PmASR2基因共设计了两对引物，分别为1-432bp长度的正向引物5-‘GGCGAGGTCAACTACGAGAA’-3，反向引物5-‘CAGACAGCACCACACGGTTA’-3、117-541bp长度正向引物5-‘CTCCCCTGACAAGTTCGCA’-3，反向引物5-‘TAGCGCACACGAGTTGAAAG’-3，扩增体系为50ul，以不同时间各个处理的糜子叶片cDNA等量混合样为模版，模版体积5ul（100ng/ul）cDNA浓度100ng/ul，正反引物各4ul（10mmol/L），2×GC-Rich PCR MasterMix25ul（KT206购自天根生化北京科技有限公司）加入ddH2O补足50ul。PCR反应程序为94℃5min，接着94℃30s，58℃30s，72℃2min共34个循环，然后再72℃延伸10min。RCR结束后取3ul产物与1ul6×DNA Loading Buffer混合在含有1%的琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物检测。检测大小片段准确后，回收并纯化目的条带，连接到克隆载体pGM-Simple-TFast Vector，热激转化感受态细胞DH5α，通过蓝白斑筛选，挑取白色菌落经菌液PCR验证为阳性克隆子后送上海美吉生工测序，测序结果经过拼接后在NCBI数据库中进行blastn比对。

1.2.4 生物信息学分析

将所得的序列，利用DNAMAN软件进行拼接，利用NCBI数据库CD-search在线分析软件进行保守域预测。利用WoLF PSORT在线软件进行亚细胞定位分析，利用NCBI中BlastP进行蛋白质结构保守域分析，计算该蛋白分子量及等电点采用ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）软件，多重比较及系统进化树利用MEGA7.0软件进行分析。

1.2.5 基因表达分析

将所得糜子ASR序列EST序列设计引物，正向引物5-‘TTGCCTGAACCCTGAAGCAT’-3，反向引物5-‘AACACCGGACCGAATTCCTG’-3各4ul（10mmol/L），根据蒋晓梅等人报道柳枝稷RT-PCR内参基因^[22]，筛选出在干旱、盐、糖胁迫稳定度高的ACT2作为糜子内参，引物序列为正向引物5-‘GCGAGCTTCCCTGTAGGTAG’-3，反向引物5-‘CGAACCCAGCCTTCACCATAC’-3，RT-PCR反应体系为20ul，经调整合适的cDNA体积，不超过2ul，正向引物和反向引物均为0.6ul、2×SuperReal Color PreMix10ul、RNase-free ddH2O补足至20ul。反应程序为95℃15min预变性，接着95℃10s，60℃30s退火加延伸，40个循环。

2.结果与分析

2.1 ASR2基因的克隆        

以糜子的第一链cDNA为模版，同时设计了两对引物并用其上下游引物进行PCR扩增，将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示1、2号引物分别扩增得到432bp和424bp长度片段（图1）。

M:DL2000 Marker;1:1-432bp长度引物扩增结果；2：117-541bp长度引物扩增结果

图1 糜子ASR2基因扩增结果

Figure 1 Broomcorn milleASR2 gene amplification results

 将目的片段进行纯化回收、连接转化、测序获得序列，所得的序列在DNAMAN软件进行拼接获得全长541bp，将所得的序列在NCBI中rpsblast分析得到这是一种由缺水胁迫引起的植物ABA / WDS诱导蛋白质（ASR），该序列包含完整的编码区域，命名为PmASR2（Genebank登录号：MH937580），该基因cDNA片段保守域长336bp，共编码112个蛋白质(图2)，且经过DNAMAN软件亲水性和疏水性预测该蛋白为亲水蛋白（图3）。

1         TGGTAAAAGGAGACTGCTCTTGAGAGCATGGCCGAGGAGAAGCACCACCACCACCTGTTC

1                                     M  A  E  E  K  H  H  H  H  L  F

61        CACCACCGCAAGGAGGAGGAGAGCTCCGGCGAGGTCGACTACGAGAAGAAGGAGAAGCAC

12         H  H  R  K  E  E  E  S  S  G  E  V  D  Y  E  K  K  E  K  H  

121       CACAAGCACTGGAGCAGCTCGGCGGCCTCGGCGCCATCGCCGCCGGCGCCTACGCTCTT

32         H  K  H  W  S  S  S  A  A  S  A  P  S  P  P  A  P  T  L  F  

181       ACGAGAAGCACAAGGCGAAGAAGGACCCCGAGAACGAGCACGGCCACCGGATCAAGGAGG

52         T  R  S  T  R  R  R  R  T  P  R  T  S  T  A  T  G  S  R  R  

241       AGGTGGCCGCCGTCGCCGCCGTGGGCTCCGCCGGGTTCGCCTTCCACGAGCACCACGAGA

72         R  W  P  P  S  P  P  W  A  P  P  G  S  P  S  T  S  T  T  R  

301       AGAAGGACGCCAAGAAGCACGGCCAAAACTGAACGCACACGCGCGCCGACGCGCGCGCAT

92         R  R  T  P  R  S  T  A  K  T  E  R  T  R  A  P  T  R  A  H  

361       GTTTATTTGCCTGAACCCTGAAGCATCTATCGCCGCTGCATGCTTGATTTGTTTTTCTTT

112        V  Y  L  P  E  P  

图2糜子ASR2基因蛋白预测结果

Figure 2 Prediction results of the Broomcorn mille ASR2 gene protein

图3亲疏水性分析图

Figure 3 Hydrophilicity analysis chart

3.2生物信息学分析

     利用WoLF PSORT在线软件进行基因亚细胞定位预测，结果显示该基因定位在细胞核内；用在线网站ExPASy（https://web.expasy.org/compute_pi/）预测PmASR2所编码的氨基酸序列蛋白质分子量为13454.92，等电点为11.39，分子式为C₅₈₁H₉₁₂N₁₉₈O₁₇₂S₁，其中富含谷氨酸和组氨酸等氨基酸。将糜子ASR2氨基酸序列对与其他已被发现的含有ASR基因八种作物(柳枝稷PUZ47142.1、马铃薯XP_006359804.1、番茄XP_004237807.1、谷子XP_004952697.1、玉米XP_008645776.1、高粱XP_002447825.1、水稻BAD28235.1、短花药野生稻XP_006647355.1)进行多重比较（如图4），可以发现这几个作物ASR氨基酸序列相似度较高，其中糜子ASR2基因氨基酸序列与高粱XP_002447825.1最相近，与番茄XP_004237807.1差异最大。

图4九种植物PmASR2氨基酸多重比对

Figure 4 Nine plant PmASR2 amino acid multiple alignment

使用NCBI-blast网站上九种植物的cDNA序列，并用MEGA7.0构建系统发育树，显示其cDNA序列相似度较高在51.2%-86.4%之间（图5），其中糜子与柳枝稷一致性最高为86.4%，与番茄一致性最低为51.2%，与谷子和高粱一致性为85.5%和84%，而番茄和马铃薯ASR基因一致性为76.4%。

图5九种植物PmASR2系统进化树

Figure 5 Nine plant PmASR2 phylogenetic tree

3.3糜子ASR2的表达分析

3.3.1在干旱、盐、糖胁迫下PmASR2基因荧光定量分析

由图6A可知糜子幼苗在PEG胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎，茎中几乎没有变化。PmASR2基因在根和叶片中相对表达量在6h达到峰值，根中是对照11.6倍，叶片中是对照的3.7倍。糜子幼苗在Nacl胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎（图6B），在茎中几乎没有变化，PmASR2基因根和叶片相对表达量在6h达到峰值，根中是对照16.7倍，叶片中是对照3.6倍。糜子幼苗在甘露醇胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎（图6C），茎中ASR基因相对表达量几乎没有变化，PmASR2基因根中相对表达量（0h-3h）逐渐上升在（3h-24h）逐渐下降，且在3h达到峰值是对照7.2倍，叶中相对表达量（0h-6h）逐渐上升在（6h-24h）逐渐下降，且在6h达到峰值是对照的5.1倍。这些结果表明PmASR2在非生物胁迫干旱、盐、糖环境下可能发挥着重要的作用，其中在干旱和盐环境中较为明显。

 A：PEG胁迫下糜子ASR基因在不同组织中相对表达量；B：Nacl胁迫下糜子ASR基因在不同组织中相对表达量；C：甘露醇胁迫下糜子ASR基因在不同组织中相对表达量

图6:PmASR2基因在各种逆境胁迫下不同部位相对表达量

Relative expression of PmASR2 gene in different parts under adversity stresses

3.3.2在植物激素胁迫下PmASR2基因荧光定量分析

如图7A所示糜子幼苗在ABA激素胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎，茎中ASR基因相对表达量几乎没有变化，PmASR2基因根中和叶片相对表达量均在6h达到峰值，根中是对照16.4倍，叶片中是对照6.8倍。如图7B所示糜子幼苗在GA激素胁迫下PmASR2基因相对表达量均无明显变化，无论在根、茎、叶中。糜子幼苗在H₂O₂激素胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎（图7C），茎中ASR基因相对表达量几乎没有变化，PmASR2基因根中和叶相对表达量均在6h达到峰值，根中是对照3.9倍，叶片中是对照2.5倍。糜子幼苗在IAA激素胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎（图7D），茎中ASR基因相对表达量几乎没有变化，PmASR2基因根中和叶片中相对表达量均在6h达到峰值，根中是对照7.0倍，叶片中是对照3.8倍。

糜子幼苗在SA激素胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞叶片＞茎（图7E），茎中ASR基因相对表达量几乎没有变化，PmASR2基因根中相对表达量在3h就保持较高水皮直至24h达到峰值是对照9.8倍，PmASR2基因叶中相对表达量在3h达到峰值是对照6.5倍。糜子幼苗在MeJa激素胁迫下PmASR2基因相对表达量在变化情况为根中＞茎＞叶（图7F），叶和茎中ASR基因相对表达量几乎没有变化，PmASR2基因根中相对表达量（0h-9h）逐渐上升在（9h-24h）逐渐下降，且在9h达到峰值是对照6.6倍。这些结果表明PmASR2基因受许多激素诱导，其中ABA、IAA、SA激素诱导较为明显。

A：脱落酸胁迫B：赤霉素胁迫C：H2O2胁迫D：生长素胁迫E：水杨酸胁迫F：茉莉酸甲酯胁迫

图7： PmASR2基因在各种植物激素胁迫下不同部位相对表达量

Figure 7: Relative expression of PmASR2 gene in different parts of various plant hormone stress

4讨论

ASR蛋白是植物中广泛存在的一类主要参与植物胁迫应答的蛋白，当植物遭受逆境（干旱^[23]、盐^[24-25]、糖^[26]及一些植物激素）胁迫时，ASR基因会被诱导，从而减轻逆境对植物细胞引起的伤害。

本研究通过查找糜子近源物种柳枝稷ASR基因cDNA，进行基因克隆及生物信息学分析，我们克隆鉴定了PmASR2基因，其全长541bp，保守域长336bp，共编码112个氨基酸，其中富含谷氨酸和组氨酸等氨基酸，该基因属于缺水胁迫引起的植物ABA / WDS诱导蛋白质（ASR）并且为亲水蛋白，这与Gonzalez等^[27]和 Li等^[28]报道一致，说明当糜子受到干旱胁迫时能促进该蛋白合成从而降低干旱对植物的损害。同时本研究对糜子PmASR2基因在PEG、NACL、甘露醇胁迫下的转录水平进行了分析，分析得到该基因在茎和叶中表达量较高而根中表达量较低，这与桑树中ASR基因在在叶、花、茎表达量大于根的研究结果一致^[29]，随着时间的延长在PEG、NACL、甘露醇处理PmASR2 基因的表达均呈现先升高后降低的趋势在根和叶片中，并且根中该基因相对表达量峰值始终高于叶片中，说明该基因在感受到逆境胁迫时优先在根中表达。Feng等人^[30]研究发现谷子ASR家族在PEG、NACL、甘露醇胁迫时基因相对表达量在根和叶有明显的增加，在茎中却开始减少，SiASR3、SiASR4和SiASR6在根中优先表达，这与本研究结果相似，说明ASR基因可能在渗透胁迫中起着一定的作用。

通过6种植物激素处理发现，随着时间增加，ABA、IAA、MeJa、H₂O₂处理中糜子PmASR2基因呈现先升高后降低的趋势，其中ABA、IAA、H₂O₂胁迫6h达到达峰值而SA处理3h就达到较高的转入水平并一直保持到24h，说明该基因受许多植物激素诱导。其中SA、IAA、H₂O₂、MeJa能够轻微的诱导PmASR基因上调表达，ABA处理下相对表达量变化最为明显，杨晓月^[31]等人在二穗短柄草中也观察到相似的研究结果，说明渗透胁迫诱导PmASR2基因上调涉及到ABA信号，参与了糜子自身抗逆保护。

研究通过对糜子PmASR2基因克隆及生物信息学分析、荧光定量表达分析，为进一步研究PmASR2基因生物学功能、进一步明确糜子PmASR2基因对逆境胁迫的调控机制等奠定了基础。

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