尾静脉注射M1构建小鼠髓系白血病模型

徐昊淼¹，程涓¹，赵勇²，许亚梅¹*

1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700 ；2.中国科学院动物所,北京 100101

[基金项目] 北京市自然科学基金( 7152092 )

【摘要】目的 应用BALB/c Nude小鼠构建M1白血病模型。方法 将9只5-6周龄的雌性BALB/c Nude小鼠随机分为A、B、C三组，每组3只，进行尾静脉注射。其中，B组接种对数生长期M1细胞悬液1×10⁶个/只，C组接种对数生长期M1细胞悬液5×10⁶个/只，A组小鼠为空白对照组，尾静脉注射等剂量的生理盐水。观察小鼠的一般状况，于造模后第0、10、20、30天检测血常规、外周血白细胞分类、外周血CD33阳性细胞比例，第30天或濒死时处死取材做组织切片病理检查。结果 模型组小鼠在接种后第10-15天出现萎靡少动、步态不稳、脊背弓起、精神不佳的状况。接种5×10⁶个/只的小鼠外周血白细胞数在第30天时升高幅度明显（P<0.05）；第20天时外周血涂片白细胞计数100个细胞中，C组白血病细胞比例最高，至第30天时造模组外周血白血病细胞比例均有增加（P<0.05）；造模后C组小鼠外周血外周血流式中CD33阳性率变化明显（P<0.05）；第30天处死取材，各模型小鼠脾脏中可见白血病细胞浸润。结论 BALB/c Nude小鼠经尾静脉注射5×10⁶个小鼠白血病细胞M1后可构建急性粒细胞性白血病模型，符合急性髓系白血病的生物学特点，高浓度成瘤更快。

【关键词】 髓系白血病；M1细胞；动物模型

Establishment of Granulocyte leukemia Model via Injection of M1 cells into the Murine Caudal Vein

Abstract Objective To construct a M1 leukemia model using BALB/c Nude mice. Methods Nine female BALB/c Nude mice, 5-6 weeks old, were randomly divided into three groups: A, B, and C. Three rats in each group were injected into the tail vein. Among them, group B was inoculated with 1×106 cells/cell suspension in logarithmic growth phase, group C was inoculated with 5×106 cells in logarithmic growth phase, and group A was blank control group. Isose of normal saline. The general condition of the mice was observed. The blood routine, the peripheral blood leukocyte classification, and the percentage of CD33 positive cells in the peripheral blood were detected on the 0th, 10th, 20th, and 30th day after modeling. The pathological examination was performed on the 30th day or at the time of sudden death. . Results The mice in the model group showed signs of wilting and less movement, gait instability, back arching and poor mental condition on the 10th-15th day after inoculation. On the 30th day after inoculation, all three groups of mice survived, and the mice inoculated with 5×10 6 cells/body were significantly lower in body weight than the other groups (P<0.05). The number of white blood cells in the peripheral blood of the model group increased with time. The number of peripheral blood leukocytes in the mice inoculated with 5×106/day increased significantly on the 30th day (P<0.05); the peripheral blood smears on the 20th day Among the 100 cells with white blood cell count, the proportion of leukemia cells in group C was the highest, and the proportion of peripheral blood leukemia cells in the model group increased on the 30th day (P<0.05). The blood samples were collected from the tail vein on the 15th and 30th day of modeling. The positive rate of CD33 in the peripheral blood of the three groups of mice (except erythrocytes), the positive rate of CD33 in the B and C groups was higher than that in the control group, and the positive rate of CD33 in the peripheral blood flow of the mice in the C group was significantly changed. (P<0.05); on the 30th day, the leukemia cells were infiltrated in the spleen of each model mouse. Conclusion BALB/c Nude mice can construct acute myeloid leukemia model by injecting 5×106 mouse leukemia cells M1 into the tail vein, which is consistent with the biological characteristics of acute myeloid leukemia. 

Key words Myeloid leukemia; M1 cells; animal model

M1细胞来源于自发性髓系白血病小鼠的骨髓，本研究应用M1细胞构建小鼠白血病模型，通过尾静脉注射的方式，模拟临床白血病累及骨髓和全身播散特点，为探索药物作用机制、筛选评价奠定基础。

1材料与方法

1.1细胞株及实验动物

小鼠白血病细胞M1购于上海素尔生物科技有限公司，常规培养并传代。SPF级BALB/c Nude小鼠，雌性，5-6周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2016-0006]，体重15-18g（平均为16.51±0.62g）。

1.2主要仪器及试剂

台式冷冻离心机（美国ThermoScientific，型号Sorvall Legend RT），CO₂培养箱（德国Heraeus公司），RPMI-1640培养基（北京利维宁生物科技有限公司），胎牛血清（天津康源生物技术有限公司），青霉素和链霉素各100U/ml（Sigma），流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司，型号EpicsXL），Anti-Mouse CD117-APC、Anti-Mouse CD33-PE-Cyanine7（ThremoFisher）。

2实验方法

2.1实验前准备

将M1细胞接种于含有20%胎牛血清的1640培养基的10cm细胞培养皿中，37℃、5%CO₂、饱和湿度条件下的培养箱中培养并传代。5-6周龄的BALB/c Nude小鼠于中国科学院动物研究所SPF层流柜中饲养，含复合维生素B的标准颗粒饲料，饮水，垫料及一切与鼠接触的物品均经灭菌处理。实验室内温度约为25℃，相对湿度为40%-70%,每日光照时间为12小时，实验前适应性饲养1周。

2.2造模

将BALB/c Nude小鼠分为A、B、C组，每组3只，共9只，其中A组为空白对照组，B、C为模型组。取对数生长期的M1细胞，将细胞悬液浓度分别调至1×10⁶个/只及5×10⁶个/只，在无菌条件下经尾静脉分别注射入B、C两组小鼠体内，对照组小鼠经尾静脉注射等剂量的生理盐水。

3模型鉴定

3.1发病情况

观察各组小鼠在接种M1细胞后的发病情况、体重变化及生存时间。

3.2外周血常规及血涂片的检查

分别于接种前及接种后第10天、第20天、第30天经尾静脉取外周血约0.1-0.2ml的加入抗凝管中，送至北京中医药大学东直门医院检验科进行血常规检查，并制备血涂片，经吉姆萨-瑞氏染色后，观察细胞形态，计算白血病细胞的比例。

3.3流式细胞技术检测

CD33是髓系细胞分化抗原，分布在分化早期阶段的髓系血细胞中，主要在于骨髓中的粒细胞和巨噬细胞前体中，此外，CD33也在外周血单核细胞上有少量表达。CD33在90%以上的急性髓系白血病中都有表达，是急性髓性白血病的治疗靶标^[1]。CD117也称为c-Kit，是由c-Kit原癌基因编码的145 kDa跨膜酪氨酸激酶，能够调节多种生物反应，包括细胞增殖，凋亡，趋化性和粘附。c-Kit突变与多种癌症中的肿瘤生长和进展相关，在急性髓系白血病中可见到c-Kit突变^[2]，固采用 Anti-Mouse CD117-APC、Anti-Mouse CD33-PE-Cyanine7标记检测M1细胞，及造模后小鼠尾静脉外周血。取50μl外周血加入2μl肝素抗凝，加入二蒸水9ml低渗裂解红细胞及血小板20s，加入1ml MPBS终止反应，离心后弃上清并加入1μl CD117-APC、Anti-Mouse CD33-PE-Cyanine7摇晃混匀，避光37℃孵育30min后上机检测。

3.4组织病理切片

处死后取小鼠肝、脾、肾固定于4%甲醛中，修整形状后通过梯度酒精法脱去组织中的水分，加入二甲苯使组织透明后进行包埋并切片，切片厚度为2μm，经HE染色后，观察白血病细胞的浸润程度。

4统计学分析

所有资料用excel记录，小鼠的体重变化，外周血白细胞计数、血小板计数、血红蛋白量等数据均以均数±标准差表示（`x±s），通过spsss20.0统计软件进行分析，两组间的比较中，符合正态分布的用独立样本t检验，不符合的用非参数检验，多组间比较，符合正态分布方差齐的用单因素方差检验，不符合的用非参数检验，P＜0.05时差异有统计学意义。

5实验结果

5.1 小鼠生存状况

接种细胞后7-15天后，模型组小鼠出现皮肤粗糙、暗淡无华、脊背弓起、萎靡少动等表现，并随着时间不断延长而逐渐枯瘦、步态不稳（图1）。实验进行过程中三组小鼠均未出现死亡。

图1 小鼠经尾静脉接种M1细胞后生存状态

Fig.1 Living state of BALB/c Nude mice after inoculation M1 cells

三组小鼠的体重随时间均有所增加，经注射后，C组小鼠体重随时间的推移先增后减，接种后第30天时，C组体重下降，明显低于A、B两组（P＜0.05），B组由于注射剂量较低，与正常组比较未见明显差别。

表1 BALB/c Nude鼠各组体重变化

Tab.1 Changes in body weight of BALB/c Nude mice in three groups

注：与第0天比较，*P<0.05；** P<0.01。

Note. Compared with the day 0, *P<0.05, ** P<0.01.

5.2血涂片及血常规检查

    模型组外周血内白细胞数随时间的推移均有增高， C组小鼠外周血白细胞数在第30天时高于A、B两组，升高幅度明显（P＜0.05），对照组前后未见明显差别，见表2。小鼠外周血血红蛋白及血小板均有所波动但无明显变化规律，见表3表4。

表2BALB/c Nude小鼠外周血白细胞计数变化

Tab.2 Changes in WBC count of BALB/c Nude mice peripheral blood among five groups

注：与第0天比较，*P<0.05；** P<0.01。

Note. Compared with the day 0, *P<0.05, ** P<0.01.

表3BALB/c Nude小鼠外周血血红蛋白含量变化

Tab.3 Changes in HGB of BALB/c Nude mice peripheral blood among five groups

注：与第0天比较，*P<0.05；** P<0.01。

Note. Compared with the day 0, *P<0.05, ** P<0.01.

表4BALB/c Nude小鼠外周血外周血血小板计数变化

Tab.4 Changes in PLT count of BALB/c Nude mice peripheral blood among five groups

注：与第0天比较，*P<0.05；** P<0.01。

Note. Compared with the day 0, *P<0.05, ** P<0.01.

镜下M1细胞多为圆形或卵圆形，细胞核较大约占面积3/4左右，有多个核仁，细胞质为深蓝色见图2。接种5×10⁶个/只细胞的小鼠第15天外周血涂片中可见少量的白血病细胞，接种1×10⁶个/只细胞的小鼠第20天观察到白血病细胞，见图2。第20天时每片计数100个细胞，C组白血病细胞比例最高，至第30天时造模组外周血白血病细胞比例均明显增多，C组最为显著，见表5。对照组外周血涂片始终未见白血病细胞

表5BALB/c Nude小鼠各模型组外周血涂片白血病细胞比例变化

Tab.5 Changes in leukemia cell percentage of mice peripheral blood among two groups

注：与第21天比较，*P<0.05；**P<0.01。

Note. Compared with the day 0, *P<0.05, ** P<0.01.

图2 M1细胞形态（吉姆萨-瑞氏染色×1000）

Fig.2 Cell morphology(Wright Giemsa staining ×1000)

图3接种M1后小鼠外周血涂片（吉姆萨-瑞氏 ×1000）

Fig.3 Leukemia cell morphology of peripheral blood among four model groups(Wright Giemsa staining ×1000)

5.3流式表达变化

M1细胞CD33及CD117的阳性表达率为99%，见图4。造模第15天、第30天通过尾静脉取血检测三组小鼠外周血中（除红细胞外）CD33阳性率， B、C两组小鼠CD33阳性率高于对照组CD33阳性率，C组小鼠外周血外周血流式中CD33阳性率变化明显，见表5。外周血中CD117阳性率极低，未见明显差异。

表5BALB/c Nude小鼠各模型组外周血CD33阳性比例变化

Tab.5Changes of CD33 positive proportion in peripheral blood of BALB/c Nude mice

注：A：m1细胞流式图；B：A组小鼠第15天外周血流式图；C：B组小鼠第15天外周血流式图；D：C组小鼠第15天外周血流式图；E：A组小鼠第30天外周血流式图；F：B组小鼠第30天外周血流式图；G：C组小鼠第15天外周血流式图。

图4M1细胞及各组小鼠外周血流式图

Note: A: m1 cell flow pattern; B: peripheral blood flow pattern on day 15 of group A mice; C: peripheral blood flow pattern on day 15 of group B mice; D: week 15 week of mice in group C Blood flow pattern; E: Peripheral blood flow pattern on day 30 of group A mice; peripheral blood flow pattern on day 30 of F: group B mice; peripheral blood flow pattern on day 15 of G: group C mice.

Fig 4 M1 cell flow pattern and peripheral blood flow pattern of each groups.

5.4 小鼠脏器组织病理学观察

各模型小鼠脾脏中可见多核肿瘤细胞浸润，核仁清，为白血病细胞浸润灶；肝肾组织结构基本正常，未见白血病细胞浸润。       

  图5 模型组鼠组织病理形态（HE染色x400）

6结论

    BALB/c Nude小鼠经尾静脉注射5×106个小鼠白血病细胞M1后可构建急性粒细胞性白血病模型，符合急性髓系白血病的生物学特点，高浓度成瘤更快。

7讨论

前期实验研究中，我们通过对SCID beige小鼠照射2GyX线预处理，，经尾静脉分别接种了1×10⁷个/只、5×10⁶个/只两种不同浓度的HL60、HL60/ADR细胞株，建立了发病时间长，生存期稳定人源性白血病模型^[3]，本次研究中我们采用了鼠源急性髓系白血病M 1进行造模，构建小鼠急性髓系白血病模型。研究选用BALB/c Nude小鼠作为模型鼠，BALB/c Nude小鼠由于无胸腺，不能正常分化T细胞，导致T细胞免疫缺陷，B淋巴细胞正常但功能缺陷，因而为我们尾静脉造模提供了良好的条件^[4-5]。目前建立白血病动物模型的方法有多种，包括尾静脉注射、腹腔注射和皮下注射三种方法，其中，尾静脉造模白血病细胞可随血液流动全身播散，能更好的模拟临床白血病累及骨髓和弥漫生长特点，贴近临床白血病患者的疾病特点。

本次研究采用了1×10⁶个/只及5×10⁶个/只两种浓度，通过接种前及接种后10天