HPLC测定保儿宁颗粒中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量

李开华*，李小英，黄晓飞（北京首儿药厂，北京，顺义  101304）

[摘要]  目的：建立保儿宁颗粒中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的HPLC含量测定方法。方法：色谱柱为WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（34：66），流速1.0 ml·min^-1，柱温为30 ℃。检测波长为254 nm，进样量为5 μl。结果：升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷与相邻峰分离良好，浓度在5～40 μg·ml^-1范围内线性关系良好（升麻素苷r=0.999 96，5-O-甲基维斯阿米醇苷r=0.999 96），其平均回收率升麻素苷为99.96%，RSD=1.23%（n=9）；5-O-甲基维斯阿米醇苷为94.95%，RSD=2.05%（n=9）。结论：本法灵敏、准确、专属性强，能准确有效地控制保儿宁颗粒中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。

关键词  保儿宁颗粒；升麻素苷；5-O-甲基维斯阿米醇苷；高效液相色谱法

保儿宁颗粒收载于部颁标准中药成方制剂第十册第145页，该处方在经典古方《玉屏风散》基础上增加药味而得，主要成分为防风、黄芪（炙）、白术、山药（炒）等7味中药，具有益气固表，健中醒脾的功用，防风作为玉屏风散的主药，也是保儿宁颗粒的主药，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷是防风中的含量控制指标。目前保儿宁颗粒标准简单，没有对产品中的成分进行含量控制。本研究采用HPLC，测定保儿宁颗粒中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，为保儿宁颗粒的质量控制研究提供了依据。

1  仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪、检测器为SPD-20AV型（190～900 nm）。升麻素苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111522-201712，含量：96.2%）和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111523-201610，含量：96.1%），保儿宁颗粒（批号：180701、180703、180706，北京首儿药厂生产）；甲醇为色谱纯，水为超纯水。

2  方法与结果

2.1  色谱条件¹

色谱柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇-水（34：66），流速：1.0 ml·min^-1，进样量：5 μl，柱温：30 ℃，检测波长：254 nm。

2.2  溶液的制备

2.2.1  对照品溶液  精密称取升麻素苷对照品10 mg，5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品10mg，置同一个50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2.0 ml置20 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（20 μg·min^-1）。

2.2.2  供试品溶液  取本品研细混匀，精密称取约5 g，置100ml三角瓶中，精密加入25 ml甲醇，称定重量，水浴回流2小时，补足重量，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3  阴性溶液  按处方称取缺防风的其他药味适量，制成缺防风的阴性样品，同法制备缺防风的阴性样品溶液。

2.3  方法学研究²

2.3.1  系统适用性试验

在上述色谱条件下，升麻素苷与其相邻色谱峰的分离度为2.5，理论板数按升麻素苷峰计算为4737，5-O-甲基维斯阿米醇苷与其相邻色谱峰的分离度为13.1，理论板数按升麻素苷计算为6614。系统适用性符合规定。

2.3.2  专属性试验

将对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各精密吸取5 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果，阴性样品色谱图中，在升麻素苷对照品及5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品色谱峰的相同保留时间处无色谱峰，说明阴性样品无干扰，专属性符合要求。色谱图见图1。

图1：A. 对照品  B. 阴性样品  C. 供试品  1. 升麻素苷  2. 5-O-甲基维斯阿米醇苷

2.3.3  线性关系考察  精密称取升麻素苷对照品10 mg，5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品10 mg，置同一个50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。再分别吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml至20 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，分别配制出含升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷5、10、20、30及40 μg·ml^-1的系列对照品溶液。精密量取上述溶液各5 μl注入液相色谱仪测定。分别以升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷浓度（μg·ml^-1）为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程分别为：Y==977 6.82x+226 8.70（r=0.999 96，n=5）；Y=103 69.8x+238 1.13（r=0.999 96，n=5）。试验结果表明在5～40 μg·ml^-1浓度范围内线性关系良好，满足含量测定要求。

2.3.4  精密度试验

精密吸取同一供试品溶液（批号：180706），进样6次，每次5μl，依法测定，其升麻素苷峰面积积分值的RSD为0.806%，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积积分值的RSD为0.984%，结果表明精密度良好。

2.3.5  稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：180706），分别于配制后的0，8，12，24，48 h，精密吸取5 μl，注入液相色谱仪，测定，结果表明，供试品溶液在配制48 h内稳定。

2.3.6  重复性试验

取同一批样品（批号：180706），依法制备6份供试品溶液，测定其中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，结果其平均含量为0.180 mg·g^-1，RSD=0.8%，表明本方法重复性良好。

2.3.7  中间精密度试验

由三名实验员分别取同一批样品（批号：180706），各依法制备2份供试品溶液，测定其中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量，结果其平均含量为0.183 mg·g^-1，RSD=1.27%，表明中间精密度良好。

2.3.8  加样回收率试验

取同一批样品（批号：180706），精密称取9份，在加入25ml提取溶剂后，称定重量（w₁），分别加入配制浓度为0.5 mg/ml对照品溶液0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml，加入后水浴回流2小时，补足损失，按同法进行后续提取操作，每个浓度平行制备供试品三份，测定，计算回收率，结果平均回收率升麻素苷为99.96%，RSD为1.23%（n=9），5-O-甲基维斯阿米醇苷为94.95%，RSD%为2.05%（n=9）。

2.3.9  耐用性试验

采用拟定的方法，对供试品回流时间、不同流动相比例、不同柱温及不同流速使用同一批供试品进行考察，结果一致，证明本方法耐用。

2.3.10  样品含量测定

取三批保儿宁颗粒样品，按“2.2”项下的方法分别制备供试品溶液与对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，结果见表1。

表1  样品含量测定（mg·g^-1，n=3）

3  讨论

3.1  色谱柱的选择

分别使用了Kromasil 100-5-c18、Diamonsil C18、ZORBAX Eclipse XDB-C18、WondaSil C18色谱柱，其中WondaSil C18分离最好，能满足系统适用性要求，其他色谱柱分离达不到要求，建议更换仪器或色谱柱前，先进行系统试验，选择符合系统适用性要求的色谱柱再进行检测。

3.2  本次研究中，5-O-甲基维斯阿米醇苷的加样回收率较低，只有94.5%，但根据《中国药典》2015年版四部“9101 药品质量标准分析方法验证指导原则”，对于本产品中待测成分含量和回收率限度的关系，回收率限度在85～110%即可，所以本法可行。

[参考文献]

1、《中国药典》2015年版一部第149页

2、《中国药典》2015年版四部“9101 药品质量标准分析方法验证指导原则”第374页