龈下菌斑采集保存的方法

黎凯歌  综述；厉松  审校

（首都医科大学附属北京口腔医院正畸科，北京 100050）

【摘要】 龈下菌斑是位于龈缘以下，分布在龈沟或牙周袋内的口腔微生物，与牙周病的发生发展密切相关。近年来学者们对龈下菌斑的构成、生物学特性、致病机制等做了大量的研究，而这些研究的基础都在于准确的采集保存龈下菌斑样本，本文就龈下菌斑的采集保存方法做一综述。

【关键词】 龈下菌斑、样本采集、样本保存

Methods fort the collection and preservation of subgingival plaque

LI Kai-ge，LI Song

（Department of Orthodontics，School of Stomatology，Capital Medical University，Beijing 100050，China）

【Abstract】 Subgingival plaque is an oral microorganism located below gingival margin and distributed in gingival sulcus or periodontal pocket, which is closely related to the occurrence and development of periodontal disease. In recent years, scholars have done a lot of studies on the composition, biological characteristics and pathogenic mechanism of subgingival plaque, and the basis of these studies is to accurately collect and preserve subgingival plaque samples.

【Key words】 subgingival plaque、sample collection、、sample preservation

龈下菌斑是牙周微生态系的重要组成部分，其包含了多种细菌既有固有菌群也有牙周致病菌。正常的机理状态下，牙周微生物与宿主之间保持生态平衡。而一旦此平衡被打破，龈下菌斑中牙周致病菌增多、致病性增加则引起宿主牙周组织局部炎症，进而结合上皮根方迁移，病理性牙周袋形成、牙槽骨吸收最终导致牙齿松动脱落。

菌斑生物膜是牙周炎的始动因子，菌斑中的多种牙周致病菌如牙龈卟啉单胞菌、具合梭杆菌、伴放线聚集杆菌、中间普氏菌、齿垢密螺旋体等被认为与牙周炎的发生发展密切相关。通过监测龈下菌斑的结构组成，观察牙周致病菌的数量、比例和致病性等，不仅可以检测牙周治疗的效果，还可以为牙周病早期的诊断提供依据，从而达到预防疾病发生发展的目的。对龈下菌斑的研究方兴未艾，龈下菌斑样本的采集和保存对最终的检测分析结果有决定性的影响，样本的采集也被认为是微生物研究主要的误差来源之一^[1]。工欲善其事必先利其器，所以龈下菌斑的采集和保存作为我们进入牙周微生态领域的门户显得至关重要。

一． 龈下菌斑的采集

1.样本采集前的预处理

研究者^[2-6]通常在样本采集前采用如下预处理方式：嘱受检者用温开水轻轻漱口，用已消毒的探针或龈上洁治器轻轻去除龈上菌斑，用消毒棉球或棉卷隔湿取样牙，然后将牙龈表面及牙面轻轻吹干，以免采集的龈下菌斑样本被污染或稀释。

2.样本采集位点： 

由于每颗牙齿的龈下菌斑都有其特异性,菌群构成不可能完全相同，故采集位点是影响龈下菌斑检测结果的重要因素之一。当然能采集到全口所有牙位的龈下菌斑最为全面，但是此法太过费时，患者的配合度和接受度会随之下降，实际临床工作中实施起来难度较大。通过选取能准确反映患者口内龈下菌斑实际情况的具有代表性的部分位点既简单又省时省力。Persson, G. R.^[7]等进行了龈下菌斑是否存在位点特异性差异的研究，在各实验位点探针深度均为5~7mm的前提下，实验结果显示磨牙、前磨牙、切牙/尖牙龈下菌斑与牙周炎相关的37种细菌检出率和水平相似，没有显著差别。王丽等^[2]比较了选取患者每个象限内牙周探诊最深位点采集龈下菌斑（简称4-site法）和采集全口龈下菌斑对慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、伴放线菌嗜血菌、具核梭杆菌检出的影响，结果显示两种方法一致性较好，无显著差异，通过4-site法采集到的龈下菌斑样本具有良好的代表性。目前众多对龈下菌斑的研究均选择每个象限内探诊最深位点进行取样^{[3, 4, 8]}，也有研究者仅选择全口探诊最深的一个位点^{[5, 9]}。Casas, A^[6]等比较选取每个象限内探诊最深位点（4-site法）和全口探诊最深的一个位点（1-site法）进行取样对龈下菌斑检出率的影响，结果显示4-site法采集的样本中厌氧菌的总数要显著高于1-site法，但每个病原菌的计数和微生物群的百分比没有显著的差异。Nickles, K等^[10]比较了选取每个象限内探诊最深位点（4-site法）和每1/6区内探诊最深位点（6-site法）对龈下牙周致病菌检出率的影响，结果显示相比4-site法，6-site法各牙周致病菌的检出率稍高，但二者无显著差异。由此可见，4-site法兼具了简便易行和良好代表性的优点。因此，当实验对象为牙周炎患者时，可以采用4-site法进行样本采集。而对于健康人群或者只有牙龈炎没有病理性牙周袋的人群来说，可选取Ramfjord指数牙(牙位分别为16、21、24、36、41、44)作为研究位点。早在1968年，Ramfjord^[11]及其所在的机构就做了许多研究显示这六颗牙能准确反映个体的牙周状况。因此当实验对象是牙周健康人群，比如正畸医生想要研究牙周健康的正畸患者在治疗前、中、后龈下菌斑的变化时可以采用Ramfjord指数牙作为研究位点。

3.样本采集方法： 

菌斑生物膜是微生物在自然界存在的主要生态形式，是细菌生存、代谢和治病的基础。与牙周炎相关的龈下菌斑分为附着性龈下菌斑和非附着性龈下菌斑。前者附着于牙根面，由龈上菌斑延伸入龈沟或牙周袋内；后者位于前者的表面或直接与龈沟上皮、袋内上皮接触。其中非附着性龈下菌斑与牙周炎的发生发展关系密切，被认为是牙周炎的“进展前沿”^[12]。目前经记载的采集方法有如下几种。

（1） 带有充气导管的采集器：二十世纪七十年代，Newman等^[13]介绍了一种带有充气导管的采集器，经采集前预处理后，在采样时不断充注无氧气体，以防止样品与空气中的氧接触。这种采集器通过前端的倒刺针采集样本，倒刺针浸有藻酸钙并有铝箔帽套保护，外面再罩上导管。铝箔帽套和外层导管都能有效的避免倒刺针采样时，龈上菌斑和唾液对标本的污染。缠绕在针端的藻酸钙有扩散菌斑的作用。然而此法中外导管有一定体积，使用时不够方便，容易引起牙龈出血；导管和倒刺针是不锈钢的，其中所含的铬有促进标湿标本氧化的作用，且缠绕在针端的藻酸钙对某些厌氧菌可能有抑制作用。

（2） Morse 00取菌器：二十世纪八十年代，Moore等^[14]介绍了一种可卸式取菌器，并命名为Morse 00取菌器。该取菌器有一可伸缩并能卸下的活动端，活动端的前端为镀镍的刮匙器，经预处理后，取菌器伸入龈下之后将取菌器的活动端推出，用刮匙器采集样本，然后将其缩回外套，取出取菌器，最后在4秒钟内用无菌镊子将可卸下的活动端取下，放入充注有CO₂的稀释液管内送检。由于使用镀镍的刮匙器，不产生促进标本氧化的作用，且表面光滑不易引起牙龈出血。与其他龈下菌斑采集方法相比，此法能采集到更多的附着性龈下菌斑。但此法同样存在操作复杂，技术敏感性较高的问题，因此鲜为人所采用。

（3） 刮匙法：用无菌刮治器伸入龈下，到达龈沟或牙周袋底后刮取龈下菌斑。刮治器采集法是目前龈下菌斑采集方法中应用极为广泛的一种，不少学者都应用此法采集龈下菌斑^{[15, 16]}。此法相对简单方便，但也需要采集者经过严格的训练，不然刮治器不易到达牙周袋底顺利取样还容易损伤到牙周组织引起出血。此法采集菌斑量较大，但采集的标本主要是根面附着性菌斑，且对龈下微生态系统的干扰较大，可重复性较差^[17]。但也有学者研究了刮治器采集龈下菌斑的可重复性，结果显示在四组不同深度的牙周袋类别中，各组内七次连续取样获得的样本中受测的40种微生物的平均比例没有显著差异，提示刮匙法可作为采集龈下菌斑的一种可靠和可重复的方法^[18]。

（4） 纸尖法：无菌纸尖采集法是目前龈下菌斑采集方法中应用最为广泛的一种。标本采集前同样是经过去除龈上菌斑，隔湿干燥的预处理，然后用无菌镊子将无菌吸潮纸尖直接插入龈沟或牙周袋内至有轻微阻力即停止，放置一定时间后取出。目前关于吸潮纸尖插入龈沟或牙周袋内后放置的时间没有一个统一的标准，放置时间短则采集到的样本量少，放置时间长则易被污染，绝大多数学者的放置时间为10~30s^[19-22]。此法的优点在于使用极其简单方便，操作技术敏感性低，相对可以标准化，重复性好，对龈下微生态干扰小。但此法也存在一些缺点：纸尖在到达牙周袋底部之前，易被龈沟液润湿而变软，故较难到达袋底部，而袋底部牙周致病菌集聚较多；且采集到的菌斑中主要是非附着性龈下菌斑，附着性龈下菌斑极少^[23]。有研究者尝试用滤纸条代替纸尖，研究结果显示滤纸条和纸尖法采集到的样本细菌数量相似^[22]。但值得注意的是采样用滤纸条一般需事先裁剪成合适的大小，不易夹持操作不便，且滤纸条的边缘呈直角较锋利，增加了损伤牙周组织的风险。相比之下纸尖呈锥体状，无锋利边缘，易于镊子夹持，伸入龈沟或牙周袋内较顺畅，不易损伤牙周组织，采样更方便可靠^[24]。

刮匙法和纸尖法是目前采集龈下菌斑最常用的两种方法。Jervoe-Storm, P.M 等^[25]通过RT-PCR分析比较了刮匙法和纸尖法龈下菌斑取样的区别，在同一采样位点先用纸尖取样再用刮匙取样，结果显示样本中总的细菌数目刮匙法要高于纸尖法，就整个目标病原菌在菌斑中的组成来说二者相似，刮匙法和纸尖的检测结果一致性好，因此Jervoe-Storm, P.M 等认为两种方法均可用于龈下微生物诊断学。Belibasakis, G N等^[26]也做了类似的研究，旨在探讨龈下菌斑的采集方法是否会影响微生物的检测结果，同样是在相同的位点先用纸尖再用刮治器取样，结果显示刮匙法和纸尖法采集的样本中总的细菌数目没有显著差异，三种红色复合体—牙龈卟啉单胞菌、福赛坦氏菌、齿垢密螺旋体的检出率一致性好，无显著差异，但是三种红色复合体中的任意一种检出水平都是纸尖法显著高于刮匙法。而伴放线聚集杆菌的一致性仅为56%，纸尖法采集的样本中更容易检测到伴放线聚集杆菌。考虑到不同研究者得出的结论不同，刮匙法采集的样本主要为龈下附着性菌斑，且易干扰龈下微生态系统，纸尖法采集的样本主要为龈下非附着性菌斑，在研究目的、条件、患者配合等允许的情况下先用纸尖法取样再用刮匙法取样，然后将二者采集到的样本合并不失为一种为获取完整龈下菌斑样本的好方法。

二． 样本的保存：

1. 样本保存的目的

由于临床上常需要将不同时间点采集到的患者龈下菌斑样本统一进行检测分析，这就需要将先采集到的样本置于特定的环境下保存如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，以使龈下菌斑的代谢在统一检测分析前尽量处于相对静止的状态，保持其生物学、免疫学等各种特性，防止其变异、死亡，使得检测分析结果能够尽可能准确的反映采样时患者的龈下菌斑。

2. 样本保存的方法

微生物的保存方法有很多，口腔微生物常用的方法有传代培养保存法、石蜡油覆盖保存法、冷冻保存法（低温冷冻保存和液氮冷冻保存）和冷冻干燥保存法。由于采集到的龈下菌斑应该尽快送检分析，一般只需做短期保存。低温冷冻保存法因具有简单、方便、经济、即可短期亦可长期保存菌种的优势，使研究者们最常采用此法保存采集到的龈下菌斑样本。但不同的研究者使用此法时的温度、保存媒介却不尽相同。Belstrom, D等^[15]将采集到的龈下菌斑样本置于无菌生理盐水储存于-80℃的温度下。Jensen, A等^[16]将样本置于PowerLyzer™ PowerSoil®珠状溶解缓冲液储存于-80℃的温度下。van der Horst, J等^[19]将样本置于空的无菌微型管内储存于-80℃的温度下。Guentsch, A等^[22]将样本在4℃下置于磷酸盐缓冲液中稀释一晚，然后离心，取出纸尖或滤纸条，将上清液储存于-20℃的温度下。Pan, S等^[27]将样本置于磷酸盐缓冲液中储存于-20℃的温度下。Hagenfeld, D等^[28]将样本置于空的无菌收集管内储存于-20℃的温度下。Longo, P L等^[29]将样本置于TE缓冲液 (10 mM Tris–HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.6) 储存于-80℃的温度下。一般来说温度越低，细菌的代谢越不活跃，保存时间越长。取样后立即冻存在-20℃或更低温度下被认为是微生物保存的金标准^[30]。研究者们可根据自己实验室的条件合理选择龈下菌斑样本的储存温度。目前对于保存媒介的研究较缺乏，在上个世纪，曾有研究者们^{[31, 32]}比较了不同保存媒介对龈下菌斑样本的影响，但没有一个金标准，也就造成了研究者们选择保存媒介时的不一致，所以对于龈下菌斑样本的保存媒介仍需进一步的科学研究。

三． 小结

口腔是人体五大菌库（口腔、肠道、皮肤、阴道和鼻腔）之一 , 经检测出的微生物大约有700多种，龈沟内相对厌氧和缺乏唾液冲洗清洁等特点更是易于细菌的定植。对龈下菌斑的研究主要是对牙周致病菌的研究，首先得保证正确的采集到尽量完整的龈下菌斑并且不受唾液血液等的污染，然后尽量使龈下菌斑的代谢在检测前处于相对静止的状态，保持其生物学、免疫学等各种特性。研究者们可根据自身的研究目的、临床及实验室条件、患者的类型配合度等综合考量选择合适的采集位点、方法并进行妥善的保存，才能使最终得到的检测分析结果具有说服力。

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