两种样品稀释液对口蹄疫O型抗体ELSIA检测结果的影响研究

耿玉静，吴彬，杨志，李秀梅，任雪建，吕园园

洛阳现代生物技术研究院有限公司

（耿玉静，1984年9月，女、汉族，河南安阳，研究生学历，兽医诊断制品，）

摘要：以样品稀释液1和样品稀释液2分别对55份血清进行稀释，按照竞争ELSIA方法进行检验，比较两种稀释液对检测结果的影响。结果用样品稀释液2稀释的血清检测结果明显较稳定，偏差缩小，有利于提高试剂盒检测结果的准确性。

关键词：样品稀释液；竞争ELISA；准确性

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒感染引起的以偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病，能够感染多种偶蹄家畜，使动物生产性能下降，给动物生产造成巨大的经济损失，被国际兽医局（OIE）列为一类传染病^[1]。抗体检测在口蹄疫的诊断及免疫监测中具有重要作用，开发一种稳定、高效的检测方法很有必要。

1 材料

样品稀释液1  称取Na₂HPO₄ 2.9g、KH₂PO₄ 0.2g、NaCl 8g、KCl 0.2g，加入800ml双蒸水搅拌溶解，再称取BSA 10 g加入，量取PROCLIN-300 500µl、吐温-20 1ml加入，而后加双蒸水定容至1000ml，过滤除菌，无菌定量分装，2～8℃保存。

样品稀释液2  Na₂HPO₄ 2.9g、KH₂PO₄ 0.2g、NaCl 8g、KCl 0.2g，加入800ml双蒸水搅拌溶解，再称取EDTA.2Na 5g、酪蛋白10g、聚氧乙烯月桂醚0.2g加入，量取1ml PROCLIN-300、2ml曲拉通-X100加入，搅拌均匀，而后加双蒸水定容至1000ml，过滤除菌，无菌定量分装，2～8℃保存。

1.2  检测样品  从规模化猪场、牛场、羊场采集的免疫和非免疫血清，经韩国金诺口蹄疫O型抗体检测试剂盒检测，口蹄疫O型病毒阳性血清14份、阴性血清10份。

口蹄疫A型、亚洲1型、猪瘟病毒阳性血清、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒阳性血清、大肠杆菌阳性血清各1份，口蹄疫A型病毒阳性血清13份，口蹄疫亚洲1型病毒阳性血清13份。

2 方法

2.1  建立口蹄疫O型抗体检测竞争ELISA方法  将1.5μg/ml的口蹄疫O型重组蛋白，100μl/孔的量加入酶标板中，置2～8℃包被12小时，用洗涤液洗板2次，甩掉孔中液体，拍干，加封闭液150μl/孔，置37℃封闭2小时，甩掉孔中液体，37℃干燥3小时后，置2～8℃保存备用。

2.2  检测结果比较  用样品稀释液1和样品稀释液2分别对以上血清进行稀释后检测，比较两种稀释液对血清检测结果的影响，比较符合率及特异性。

3 结果  按照建立的竞争ELISA检测方法对样品进行检测，分析样品稀释液1和样品稀释液2对检测结果的影响。检测结果显示，用样品稀释液2检测结果较稳定，准确性更好。见下图1、图2、图3、图4。

图1  口蹄疫O型阳性血清OD值分析图

图2  口蹄疫O型阳性血清S/N值分析图

由上表1，用样品稀释液1稀释检测，血清编号21、37、46 的检测结果为阴性，但S/N值接近临界值；用样品稀释液2稀释检测，血清编号21、37、46的OD值有所升高，S/N值降低，更符合对阴性血清检测结果的判断。图1和图2可见，血清编号3、9、11血清OD值有明显降低。总体来看，用样品稀释液1时口蹄疫O型阳性血清检测结果OD值在0.082~0.562之间，用样品稀释液2时口蹄疫O型阳性血清检测结果OD值降低，在0.072~0.377之间，S/N值总体更趋于平稳，检测结果的精密度更好。

图3 口蹄疫O型阴性血清、A型、亚1、特异性血清检测OD值分析图

图4 口蹄疫O型阴性血清、A型、亚1、特异性血清检测OD值分析图

由表1、图3和图4显示，口蹄疫O型阴性血清、口蹄疫A型阳性血清、口蹄疫亚洲1型阳性血清和猪瘟、猪繁殖与呼吸障碍综合征、大肠杆菌阳性血清用样品稀释液1时，检测结果OD值在0.758~1.381之间，均值为1.062；用样品稀释液2的检测结果OD值在0.851~1.302之间，均值为1.125，有明显升高，且S/N值总体降低。

但是用两种稀释液稀释的血清，按“用法与判定”检测的结果一致，均为14份口蹄疫O型病毒抗体阳性、41份口蹄疫O型病毒抗体阴性。

以上结果说明口蹄疫O型抗体检测竞争ELSIA方法用样品稀释液2，使检测数据的精密度更好，检测结果更准确。因此，选用样品稀释液2作为口蹄疫O型抗体检测竞争ELSIA方法的样品稀释液组分。

4 讨论

畜牧养殖业的规模不断扩大，集约化养殖水平不断提高，人们对食品安全问题的不断重视，促进兽用生物制品产业的快速发展。疫苗免疫作为重要的疫病控制手段，研发水平和市场份额均得到快速提升。与之相关的检测技术也迅速发展。

样品稀释液是影响ELSIA检测结果的重要因素之一^[2]，样品稀释液选择不佳也会提高本底值，引起非特异性反应。因此通过对稀释液的优化，可有效降低本底，减少非特异性反应。

目前行业内使用的样品稀释液基本都是通用的PBST液^[3]，由十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、吐温-20组成。优点是生产成本低廉，缺点是仅有盐缓冲液而无法对样本待测物进行有效保护，且与血清环境有较大区别，基质效应明显，影响检测结果的准确性。EDTA.2Na为金属离子螯合剂，通过抑制部分蛋白酶从而保持溶液中蛋白的活性，保证抗原抗体反应的正常进行；酪蛋白具有降低本底，增强对蛋白的保护作用；聚氧乙烯月桂醚和曲拉通-X100^[4]两种表面活性剂，具有增大抗原抗体反应亲和力的作用，能够降低酶标板非特异性吸附作用；PROCLIN-300为防腐剂，保持溶液试剂在一定时期内不变质。通过对以上试剂进行研究，优化产品稀释液的配比，对检测结果产生一定的影响，为今后检测技术的发展具有重要作用^[5]。

参考文献：

[1] Kitching R P.Foot and mouth disease :current worlds ituation[J].Vaccine,1999,17:1772- 1774.

[2] Gaimei DU, Maojun LIU,Yuan GAN,et al. Study on Screening of Optimal Blocking Buffer and Sample Diluent for ELISA[J]. Agricultural Science & Technology,2013,14(6):816~819,837.

[3] 王海燕，袁飞，吴亚君等.食品中过敏原胡桃间接竞争ELISA检测方法研究[J].中国食品学报,2010,10(5):217-222.

[4] 孙汝瑞，黄品鲜，李伟光等.曲拉通-X10为表面活性剂形成石油醚与水乳液稳定性的研究[J].应用化工,2013,42(1):26-29.

[5] Gaimei DU,Maojun LIU, Yuan GAN,et al.Study on Screening of Optimal Blocking Buffer and Sample Diluent for ELISA [J].Agricultural science and technology,2013,14(6):816-819,837.