RP-HPLC同时测定壮药清解雾化液4种成分的含量

秦素红¹，莫小林^1*，周雨晴¹， 杜沛霖²

（1广西中医药大学第一附属医院，南宁530023；2广西中医药大学，南宁530023）

[摘要] 目的：建立RP-HPLC同时测定壮药清解雾化液中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷4种指标成分的含量测定方法。方法：应用日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，SPD-20A检测器，WondaCract ODS-2 （4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以乙腈溶液（A）－0.2％磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱；流速1.0ml/min，检测波长355nm，柱温35 ℃。结果：绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的进样量分别在2.22-5.55μg、0.330-0.825μg、0.208-0.52μg、0.3485-0.8713μg范围内线性关系良好（R²≥0.9997）；加样回收率为97.5%～102.35%，RSD 值为1.15%～2.14%。结论：该方法专属性、稳定性、重复性高，灵敏、简便，可应用于壮药清解雾化液制备工艺质量控制。

关键词：壮药清解雾化汤；绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷；RP-HPLC；

Simultaneous Determination of Four Chemical Components in Qingjie Atomized Liquid by RP-HPLC

 QIN Su-hong¹ , MO Xiao-lin^1*, ZHOU Yu-qing¹, DU Pei-lin²

1. The First Affiliated Hospital of Guangxi University of TCM, Nanning 530023, China

2.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China

[Abstract] Objective: To develop an RP-HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid, rutin, hyperoside and isoquercitrin in in Qingjie Atomized Liquid. Methods: Separation was carried out an WondaCract ODS-2(4.6mm×250mm,5μm),eluted with mobile phase of 0.2% phosphoric acid solution(B)-acetonitrile(A) in gradient mode.The flow rate was 1.0ml/min. Column temperature was 35℃ and detection wavelength was set at 355nm. Result: Linearity was good for chlorogenic acid, rutin, hyperoside and isoquercitrin in range of 2.22-5.55μg,0.330-0.825μg,0.208-0.52μg,0.3485-0.8713μg.respectively,Average recoveries of 4 compounds were 97.5%-102.35%,RSD(1.15%-2.14%).Conclusion:The method is accurate,stable,repeatable, sensitive and simple, can be used for quality control of Qingjie Atomized Liquid.

壮药清解雾化液为广西中医药大学第一附属医院在研医疗机构制剂，全方由桑叶、千里光、岗梅根、一点红壮药材组方，具有疏风清热、解毒利咽的功效^[1]。经查阅文献，组方药材中的化学成分包括生物碱、黄酮类和咖啡酰奎宁酸类等^[2-4]，本文对其主要有效成分为芦丁、绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷进行研究，建立RP-HPLC同时测定4种指标成分的含量测定方法，为完善壮药清解雾化液质量标准提供依据。

1　仪器与试药

1.1　仪器   LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GH-25电子分析天平（日本A&D公司）； CD-UPT超纯水机（成都越纯科技有限公司）；H1650医用离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；

1.2　试药  岗梅根、一点红、千里光、桑叶药材（由广西南宁万宝堂药业提供），经广西中医大学田辉教授鉴定符合《中国药典》2015年版一部各品种项下标准。绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-201413、100080-201409、111521-201405、111809-201402）；乙腈为色谱纯（美国Fisher公司），水为超纯水，其他试剂均为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）。

2　方法与结果

2.1色谱条件　WondaCractODS-2 （4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以乙腈溶液（A）－0.2％磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱；洗脱程序,见表1;流速1.0ml/min，检测波长355nm，柱温35 ℃，进样量20μL。色谱图见图1。

表1  梯度洗脱时间程序

2.2  供试品溶液  

精密移取壮药清解雾化液25ml，水浴蒸干，甲醇溶解转移至25ml容量瓶，超声处理30min，放冷，精密加入甲醇定容至刻度线，摇匀，10000r/min离心5分钟，取上清液，用微孔滤膜（0.45um）滤过，取续滤液，即得壮药清解雾化液供试品。

2.3　阴性对照溶液

按照壮药清解雾化液组方工艺配制缺少千里光的阴性样品，再按“2.2”项下方法制备缺千里光阴性对照液；同上配制缺少一点红、千里光、桑叶的阴性样品，制备缺一点红、千里光、桑叶阴性对照样品。

2.4　混合对照溶液

精密称取对照品绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷,加甲醇溶解制成对照品

母液。再精密依次吸取一定体积对照品母液于同一容量瓶,甲醇定容得浓度依次为0.2220mg/ml、0.033mg/ml、0.0208mg/ml、0.03485mg/ml的混合对照品溶液,0.45μm滤膜滤过备用。

2.5　线性关系考察

   精密量取混合对照品溶液10μl、12μl、15μl、18μl、20μl、25μl，分别进样分析。以峰面积为纵坐标，对照品含量为横坐标进行线性回归。

2.6　精密度考察　

取“2.2”项下壮药清解雾化液供试品溶液，连续6次进样20μL，依法测定记录绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积，RSD依次为1.4%,1.7%,2.2%,1.2%,表明精密度良好，达到测定要求。

2.7　稳定性试验　

取壮药清解雾化液供试品溶液，分别于室温下0, 4, 8, 12, 24, 36h进样20μL，依法测定，记录绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积， RSD分别为1.9%,2.4%,2.9%, 1.8%,说明壮药清解汤供试品溶液在36h内稳定性良好，达到测定要求。

2.8　重复性试验　

按照“2.2”项下壮药清解雾化液供试品制备方法，平行制备壮药清解雾化液供试品溶液6份，进样20μL，依法测定记录绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积， RSD依次为2.0%,2.5%,2.7%,1.8%，参照2015年版《中国药典》四部药品质量标准方法验证指导原则准确度项下样品待测定成分含量和回收率限度要求，待测定成分含量0.01%，重复性RSD可接受范围为小于4，良好，达到测定要求。

2.9　加样回收率考察

　精密移取已测定含量的壮药清解汤6份各10ml,分别精密加入绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷混合对照品溶液适量，按照“2.2”项下壮药清解汤供试品制备方法液,按“2.1”项色谱条件测定, 绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷回收率在96.7%～103.5%,结果见表2。参照2015年版《中国药典》四部药品质量标准方法验证指导原则准确度项下样品待测定成分含量和回收率限度要求，待测定成分含量0.01%，回收率限度（%）范围为85~110；结果表明，符合含量测定的要求。

表2 绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的加样回收率（n=6）

表2绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷回归方程及线性范围

2.8样品含量测定

按既定工艺制3 批壮药清解汤样品，每批样品按“2. 2”项下方法分别制备 3 份壮药清解汤供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定分析，记录色谱峰面积，根据绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的标准曲线，计算各成分含量。结果见表 3。

表3壮药清解汤中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的含量测定结果（n=3）

图1 高效液相色谱图

A. 混合对照品 B. 状药清解供试品(绿原酸13.9min、芦丁36.8min、金丝桃苷39.0min、异槲皮苷40.0min)

                  c1. 缺千里光阴性对照  c2. 缺一点红、千里光、桑叶阴性对照

3　讨论

壮药清解雾化液处方包括壮药材桑叶、千里光、岗梅根、一点红；组方药材均为功效类似状药，具有相同的有效成分。经文献查阅，一点红、桑叶均含有绿原酸、芦丁、异槲皮苷 ，千里光含金丝桃苷、绿原酸、芦丁、槲皮素等^［2-4］。本研究通过保留时间和千里光专属成分金丝桃苷为参照的相对保留时间共同确定绿原酸、芦丁、异槲皮苷的色谱峰。

检测波长与流动相的确定：参照2015年版《中国药典》，千里光含量测定项金丝桃苷检测波长360nm；绿原酸检测波长是327nm；芦丁与异槲皮苷的苷元都是槲皮素，在358nm有最大吸收；结合试验测定以355nm作为检测波长^［5］。以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱；试验中混合对照品和壮药清解雾化液中四种成分均达到基线分离，基线平稳，峰型对称，色谱峰分离度大。本研究对壮药清解雾化液3个批次进行含量测定，4个成分含量差异较小，说明壮药清解雾化液质量稳定。

综上所述，本研究建立的方法稳定、准确，重复性强，可为壮药清解雾化液质量控制提供参考。

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[ 2]沈寿茂,沈连钢,张晶等. 一点红HPLC指纹图谱研究及咖啡酰奎宁酸类成分的含量测定 [J].中华中医药杂志（原中国医药学报）,2014,29(12):3790.

[3]张朝凤,陈录新,张勉等. 千里光药材的HPLC指纹图谱及ESI-MS分析[J].中国中药杂志,2008,33(18):2093.

[4]朱立华,李跃辉, 胥新元等. 不同产地千里光药材中金丝桃苷和绿原酸含量的比较研究[J].湖南中医杂志,2013,29(10):128.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:中国医药科技出版社,2015:34