玉林市番鸭细小病毒的流行状况

甘一波

(玉林市动物疫病预防控制中心，广西玉林 537000）

摘 要：为明确番鸭细小病毒（MDPV）在玉林市本地番鸭群中的流行状况，本研究通过PCR方法对2018年1-11月间玉林市135例病死番鸭样品进行番鸭细小病毒检测。结果显示，18.52%（25/135）样品感染了MDPV，MDPV已成为番鸭养殖生产的主要传染病之一，9~20日龄的雏鸭感染率明显高于其它日龄段，春秋季为疾病高发期，MDPV阳性样品中检出鸭黄病毒8.00%（2/25）、鸭圆环病毒68.00%（15/25）、禽多杀性巴氏杆菌28.00%（7/25）、大肠杆菌80.00%（20/25）、鸭I型肝炎病毒4.00%（1/25）。本地MDPV毒株基因与KM093740相近。

关键词：番鸭细小病毒（MDPV）；流行状况；病原学检测；基因同源性比对；混合感染

     EPIDEMIOLOGICAL RESEARCH OF MDPV IN YULIN CITY

Yibo Gan

(Yulin Center for Animal Disease Control and Prevention Center,Guang xi,Yilin 537000)

Abstract: The infection of MDPV in local Muscovy ducks in Yulin City was by using PCR.For this study,135 dead Muscovy ducks local samples collected during January to November 2018 were examined using PCR.Overall MDPV infection rate was 18.52%(25 out of 135).MDPV has become one of the major infectious diseases in Muscovy duck farming .The Muscovy ducks at 9 to 20 days of age were more susceptible to MDPV compared with those at other age groups.The high incidence period of diseases in spring and autumn..In MDPV positive samples,DFV 8.00% (2/25), DUCV 68.00% (15/25), Multocida 28.00% (7/25),  Coli 80.00% (20/25) and DHV- I 4.00% (1/25) were detected..The gene of local MDPV strain was similar to that of KM093740.

Key word: MDPV;epidemic research;antibody testing;pathogenic detection;Gene homology comparison;mixed infection

    番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒引起的，该病毒为单股DNA，病毒大小大约为5110bp，非结构蛋白NS影响病毒DNA复制及调节基因表达，结构蛋白VP1、VP2、VP3影响病毒DNA转运、免疫原性、衣壳形成，因VP2-VP3能够诱导机体产生抗体，作为基因疫苗的研究^[1]。MDPV主要通过病鸭的粪便与受污染的饲料、饮水、用具、人员等进行传播，3周龄内的雏番鸭较为易感，病死率可达20%~40%，本病发生无明显的季节性。主要症状为不同程度腹泻，呼吸困难，两脚无力，蹲伏在地，病程一般为2~4 d便出现衰竭死亡，解剖可看到肝脾肿大且伴有梗死灶，胰腺表面散布针状大灰白色病灶。该病最早于20世纪80年代中后期出现于中国福建和法国西部Brittany地区，现已经在国内番鸭养殖场广泛流行。为此，本研究采集玉林市部分番鸭养殖场送检的病、死番鸭组织样品，通过PCR方法进行番鸭细小病毒核酸检测，以其对发病番鸭群中的MDPV感染情况进行调查。

1 材料与方法

1.1样品采集

   样品为临床病、死番鸭的肝脏、脾脏、胰腺，共计135份，9~20日龄番鸭76份（76/135=56.30%）、20~60日龄番鸭59份（59/135=43.70%）。

1.2试剂

抽提试剂：核酸自动抽提试剂盒（天根公司）；DNA扩增试剂： PrimeScript^TM  One Step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa） ；琼脂糖为BIOWEST公司产品；DL2,000 DNA Marker(TaKaRa）。

1.3 样品处理与核酸抽提

    取肝、脾、胰腺进行研磨，加入无菌PBS缓冲液用1.5 mL离心管进行分装，8000 rpm离心8 min后取上清液进行核酸自动化抽提。

1.4 引物设计   

参考文献^[2]中鸭I型肝炎病毒（DHV-I）、鸭圆环病毒（DuCV）、番鸭细小病毒（MDPV），参考文献^[3]中禽多杀性巴士杆菌（Multocida）、大肠杆菌（Coli），参考文献^[4]中鸭黄病毒（DFV）发表的特异性引物（见表1）。引物由invitrogen^TM公司合成。

                      表1 试验所使用引物序列

 Table 1 Primer sequences of test

1.5 反应程序

   RT-PCR采用一步法进行：反应体系为25 µL，其中模板产物1 µL，上下游引物（20mmol/L）各1 µL，PrimeScript 1 Step Enzyme MiX 1 µL，RT-PCR Buffer 12.5 µL，ddH₂O 8.5 µL。

参考文献^[2]的反转录扩增程序设计：50 ℃反转录30 min,94 ℃变性2 min,然后进入94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min的循环，共进行35个循环，最后再经72 ℃延伸10 min后，于4 ℃结束反应。参考文献^[3]的扩增程序设计：95 ℃预变性5 min，然后进入95 ℃退火35 s,50 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s的循环，共进行32个循环，最后再经72 ℃延伸8 min后，于4 ℃结束反应。参考文献^[4]扩增程序设计：94 ℃预变性5 min，然后进入94 ℃变性45 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min的循环，共进行32个循环，最后再经72 ℃延伸10 min后，于4 ℃结束反应。琼脂糖凝胶电泳后观察结果，同时以去离子水为模板作阴性对照。

2 结果与分析

2.1 MDPV的PCR检测结果

从鸭组织匀浆液中提取总病毒基因组DNA后，用特异性引物进行PCR扩增，得到了与阳性样品一致的474 bp目的片段，而阴性对照无目的条带（图1）。

图1：M:Marker DL2000; 1.MDPV Positive control; 2.MDPV Negative control; 3-16.Detection sample

                     图1：MDPV核酸检测结果

Fig:Diagnostic result of MDPV by PCR

2.2 PCR产物序列测定

将其中一个核酸抽提产物回收后进行全基因测序（基因标识：YL-MDPV），采用BLAST分析，与GenBank中的KY069274、KY744743、MG932366、MH204100、NC_006147、KM093740、KR075689、KU844281、KX000918同源性比对为94.1%、94.7%、92%、93.9%、91.2%、98.9%、89.5%、90.3%、89.6%,建立基因树状分析图（见图2）

图2：基因进化树状分析

Fig:The analysis of gene phylogenetic tree of MDPV

2.3 MDPV阳性率及其日龄分布

     经过PCR检测发现，玉林市135份病死番鸭组织标本MDPV阳性率为18.52%（25/135），其中9~20日龄的番鸭阳性率为27.63%（21/76）,20~60日龄的番鸭阳性率为6.78%（4/59）   

从各年龄段可以看出，9~20日龄的番鸭MDPV阳性率明显高于20~60日龄的番鸭。

2.4  MDPV季节性流行状况

     MDPV阳性样品中， 1-2月冬季阳性率为16.00%（4/25）,3-5月春季为48.00%（12/25）,6-8月夏季为4.00%（1/25）,9-11月秋季为32.00%（8/25）（见表2）。

表2 MDPV季节性流行状况

Table 2 Seasonal prevalence of MDPV

2.5  MDPV与DHV I、DUCV、Multocida、Coli、DFV的混合感染情况

经过RT-PCR和PCR检测发现，25份MDPV阳性样品中，DHV- I、DUCV、Multocida、Coli、DFV的阳性率分别为4.00%（1/25），68.00%（15/25），28.00%（7/25），80.00%（20/25），8.00%（2/25）。剩余110份MDPV阴性样品中,DHV- I、DUCV、Multocida、Coli、DFV的阳性率分别为2.72%（3/110）、19.09%（21/110）、10.91%（12/110）、32.73%（36/110）、4.54%（5/110）（见表3）。结果显示，目前MDPV与Coli混合感染存在普遍性。

表3  MDPV阳性或阴性样品中DHV- I、DUCV、Multocida、Coli、DFV的混合感染

Table 3  Polyinfection condition of  MDPV with DHV- I,DUCV,Multocida,Coli and DFV

3 讨 论

本研究采集玉林市周边的135例病、死番鸭，涵盖了146只番鸭规模化养殖场，存栏量为36.2万只，占全市总存栏量40.7%，样品采集具有一定的代表性。

谢丽基等于2012年对广西地区的180份鸭病料进行检测发现，DHV-I阳性率为1.1%，MDPV阳性率为10%，DuCV阳性率为5.6%，与本次检测调查结果基本吻合，说明MDPV感染率远高于DHV- I与DuCV，以普遍存在本地区的番鸭养殖场。从表3可看出，MDPV阳性样品中Coli检出率最高，这可能是与MDPV侵害机体的肠道后使肠黏膜出血，抵抗力下降有关^[5]。从表2还可得知MDPV阳性样品中DUCV检出率达68.00%，阴性样品检出率为19.09%，阳性检出率仅次于Coli，说明DUCV阳性场较多，据施少华^[6]与soike^[7]等研究发现DUCV感染番鸭法氏囊后会引起免疫抑制，导致该病毒易引发MDPV混合感染。从基因同源性可以发现玉林本地毒株与Zhao,H在广西测的KM093740基因相近，而与1988年Cheng,Y在福建测的KU844281差异性较大。从各年龄段阳性率可以发现，9~20日龄的番鸭MDPV阳性率明显高于20~60日龄的番鸭，MDPV因此又称为“三周病”。从MDPV季节性数据可得知一年四季均可发生，其中以春秋季为高发期，这与当地特有的“回南天”潮湿气候存在较大关系，在动物疫病诊断方面PCR方法以其快速、准确、灵敏、特异性高的优点得到广泛应用。

近年来，不少养殖场在注射疫苗后仍存在发病情况，或许与免疫方法及病毒变异，混合感染有关，有待进一步研究。部分有发病史的养殖场通过对MDPV进行提前免疫后效果理想。MDPV目前没有特效药可治，对患病场多建议病鸭淘汰隔离，消毒场地，保持地面干爽，同时采取紧急免疫与投喂抗生素等措施。  

参考文献

1、阮二垒，陈芳艳，陈瑞爱，等. 雏番鸭细小病毒病的研究进展[J]. 中国动物检疫, 2009, 26(5):68-70.

2、谢丽基，谢芝勋，刘加波,，等. 鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT-PCR检测方法的建立[J]. 西北农业学报, 2012, 21(11):29-33.

3、张曼，韩飞，沈文正，等. 禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用[J]. 西北农业学报, 2018(2).

4、林初文，庄金秋，陈金龙，等. 鸭黄病毒SDbz株的分离与初步鉴定[J]. 中国畜牧兽医文摘, 2013, 40(4):190-194.

5、黄瑜，万春和，傅秋玲，等. 新型番鸭细小病毒的发现及其感染的临床表现[J]. 福建农业学报, 2015(5):442-445.

6、施少华，万春和，陈珍，等. 鸭圆环病毒感染的检测[J]. 中国家禽, 2010, 32(1):31-33.

7、Soike D , Albrecht K , Hattermann K , et al. Novel circovirus in mulard ducks with developmental and feathering disorders[J]. Veterinary Record, 2004, 154(25):792-3.