雷公藤甲素在Beagle犬体内的毒代动力学研究

李云峰，陈桂江，龚宝勇，刘晓霖，吴玉娥，梁金强，关业枝

（广东省实验动物监测所广州科学城-春盛药物评价中心，广州  510663）

【摘要】  目的  研究不同毒性剂量雷公藤甲素（triptolide，TR）在Beagle犬经口重复灌胃给药4周的毒代动力学，为临床合理安全用药提供科学依据。方法  采用25%高氯酸溶液和甲醇沉淀蛋白法萃取，建立UPLC-ESI/MS多反应监测方法测定血浆TR浓度。30只Beagle犬随机分成3组，分别按体重灌胃10、30、90 μg/kg·d的TR，进行连续29天的毒代动力学研究。结果  TR在1.0～200 ng/mL范围内线性良好（r＝0.9993），批内与批间精密度均小于10%，准确度在87.3%~105.1%之间，回收率大于85%。Beagle犬在第1天与第29天给药后的平均Tmax分别为（0.83±0.54、0.55±0.35、0.48±0.23）h、（0.33±0.18、0.36±0.18、0.26±0.16）h，平均T_1/2β分别为（2.37 ±1.86、1.42 ±0.50、0.95 ±0.10）h、（1.39 ±0.50、1.61 ±1.27、1.12 ±0.24）h，平均AUC分别为（5.53±2.31、27.16±8.86、90.75±18.51 μg/L*h，4.61±1.97、27.43±7.42、84.08±16.62 μg/L*h），平均Cmax分别为（3.98±0.59、13.32±2.08、51.32±18.95 μg/L，3.61±0.83、13.2±1.84、43.71±7.80 μg/L）；AUC和Cmax与剂量之间存在明显的线性相关，但不存在蓄积。结论  UPLC-ESI/MS法的专属性强、灵敏、准确、可靠，可用于测定毒代动力学研究中血浆的TR浓度；TR在Beagle犬体内吸收和消除均迅速，全身暴露量与剂量之间存在明显的线性相关，且重复给药后不存在蓄积。

【关键词】  雷公藤甲素；超高压液相色谱-质谱联用；毒代动力学；Beagle犬

 Toxicokinetic studies of triptolide in beagle dogs

Li Yun-feng，Chen Gui-jiang，Gong Bao-yong，Liu xiao-lin，Wu Yu-e，Liang Jin-qiang，Guang Ye-zhi

(Study Center for Drug Non-clinical Evaluation of Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute,

 Guangdong, 510663, China)

【Abstract】  Objective  To develop and validate a rapid and sensitive UPLC-ESI/MS method for the determination of triptolide (TR) in plasma and to study the toxicokinetic properties of TR in beagle dogs. Methods  Sample preparation consisted of liquid-liquid extraction of precipitation protein with perchloric acid and methanol from dog plasma. The analytes were well separated on an ACQUITY UPLC BEH C18 analytical column. Plasma TR was detected by multiple reaction monitoring (MRM) of UPLC-ESI/MS as its protonated molecular ions [M+H]⁺ at m/z 360.64. Toxicokinetic studies were under taken in 30 dogs following a oral dose of 10, 30, 90 μg/kg·d of TR, continuous 29 days. Results  The toxicokinetic parameters were calculated by DAS software. Calibration curves were linear over the concentration range of 1-200 ng/mL of TR with the within and between-batch precisions less than 10%. The within and between-batch accuracy was 87.3% to 105.1%. Recovery of method for TR in plasma was over 85%. The T_1/2β were (2.37 ±1.86, 1.42 ±0.50, 0.95 ±0.10) h and (1.39 ±0.50, 1.61 ±1.27, 1.12 ±0.24) h, Tmax were (0.83±0.54, 0.55±0.35, 0.48±0.23）h and (0.33±0.18, 0.36±0.18, 0.26±0.16) h, AUC were (5.53±2.31, 27.16±8.86, 90.75±18.51) μg/L*h and (4.61±1.97, 27.43±7.42, 84.08±16.62) μg/L*h, Cmax were (3.98±0.59, 13.32±2.08, 51.32±18.95) μg/L and (3.61±0.83, 13.2±1.84, 43.71±7.80) μg/L after following continuous 29 days oral administration, separately. There were no significant differences in Tmax, T_1/2β, Cmax, and AUC between the 1 and 29 day. AUC and Cmax increased proportionally with doses, but no existence of accumulation. Conclusions  The UPLC-ESI/MS method for determination of triptolide in dog plasma was sensitive, rapid, accurate and reliable. It was showed that the absorption and elimination of triptolide were rapid in beagle dogs after following oral administration, total body exposure increased proportionally with doses.

【Key words】  triptolide; UPLC-MS; toxicokinetic; beagle dogs

雷公藤甲素（又名雷公藤内酯醇，triptolide，TR）是从中药雷公藤中分离出的活性较高的环氧化二萜内酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一。TR具有显著的抗炎、抗肿瘤、抗生育及免疫调节作用等多种药理作用^[1~6]，市场上雷公藤已有片剂、缓释片、软膏剂、栓剂等多个剂型，主要用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、皮肤病等疾病的治疗^[7~9]，但一个难以解决的问题在于其治疗和毒性剂量之间的安全窗口非常小，临床使用中常伴随着一系列副作用产生。TR的药代动力学的研究报道较多^[10~14]，但犬体内的毒代动力学研究尚未见报道。本研究先建立了UPLC/MS测定犬血浆TR浓度的方法，并参照2014年SFDA颁布的《药物毒代动力学研究技术指导原则》和《药物重复给药毒性试验技术指导原则》^[15~16]对本方法进行了验证，同时进行了TR在Beagle犬体内高、中和低3个剂量的29天的长期毒性伴随毒代动力学研究，为其制剂临床的安全合理用药提供科学依据。

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1 药品与主要试剂  雷公藤甲素原料药，批号：PITR0325-A01，纯度：99.03%，规格：1 g/瓶，广州牌牌生物科技有限公司。雷公藤甲素标准品，批号：111567-201404，含量：99.8%，规格：20 mg/瓶，购自中国食品药品检定研究院。质谱级甲醇，4L/瓶，批号：158673，赛默飞世尔（Fisher）公司。试验用水为超纯水，乙腈、甲酸、高氯酸、二甲基亚砜（DMSO）等试剂为分析纯。

1.1.2主要实验仪器  沃特世UPLC/XEVO TQ-S三重四极杆液质联用仪（含温控自动进样器、ESI复合源等）及UNIFI软件（沃特世有限公司）。MS3 Basic振荡器（德国IKA有限公司），其他仪器为国产。

1.1.3  实验动物  Beagle犬30只，雌雄各半，体重（7.75 ±0.67） kg，购自北京玛斯生物技术公司（许可证号：SCXK（京）2016-0001），试验前适应性观察2周。本单位是获得“国际实验动物评估和认可管理委员会（AAALAC International）”认证的机构，动物使用通过了IACUC批准和监督检查。

1.2  方法

1.2.1 液质色谱条件  色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm× 50 mm，1.7 µm，美国Waters公司)；柱温为40 ℃，流动相为0.1%甲酸水: 0.1%甲酸甲醇=65: 35 (V/V)，3 min，流速为0.4 mL/min，进样量5 μL。离子源为ESI源，源温度120℃，脱溶剂温度450℃，毛细管电压0.5 kv，锥孔电压30 v，MS碰撞能4 ev，碰撞气体流速0.15 L/min，正离子方式检测：扫描方式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM），用于定量检测的离子为［M+H］：TR m/z 360.64；锥孔吹气流速150 L/h，脱溶剂气体流速750 L/h。

1.2.2 溶液的配制  精密称取雷公藤甲素标准品10.0 mg于100 mL的棕色容量瓶中，乙腈溶解定容配成浓度为100 μg/mL的TR标准品储备液，放置2~8℃冰箱内保存备用。准确称取适量TR原料药于10 mL的棕色容量瓶中，加入DMSO水溶液（5:1，V/V）溶解定容，配成浓度为8.3 mg/mL的TR母液，再分别取适量的TR母液，加纯水配成浓度分别为90、30、10 μg/mL的药液供Beagle犬灌胃使用（给药量为1.0 mL/kg·bw）。

1.2.3 血浆样品处理  准确吸取犬血浆样品0.5 mL至5 mL干净离心管中，先加入25%高氯酸溶液0.10 mL，混匀后再加入甲醇0.4 mL，混合振荡2 min，5000 rpm离心8 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后加入进样瓶中进行分析测定。

1.2.4 标准曲线  于干净EP管中分别加入不同量的TR标准储备液，再分别加入犬空白血浆0.5 mL涡旋混匀，配成TR浓度为1、2、10、20、40、200 ng/mL的系列标样血浆，同时取1份空白血浆0.5 mL，按 “血浆样品处理”项下操作，按“色谱条件”进样测定，记录各浓度样品的色谱图。以TR血浆浓度为横坐标，TR峰面积为纵坐标，用最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程即为标准曲线。

1.2.5 方法专属性  分别取40%甲醇水溶液、TR标准品溶液适量，按“色谱条件”进样测定，得空白溶剂和TR标准品色谱图；取犬空白血浆0.5 mL，按“血浆样品处理”项下操作，按“色谱条件”进样测定，得空白血浆色谱图；再取适量TR标准品溶液加入犬空白血浆中，依同法操作，得加标样色谱图；要求犬血浆中内源性杂质和溶剂峰不干扰TR的测定。

1.2.6 准确度和精密度  于干净EP管中精密加入不同量的TR标准品溶液，再分别加入空白血浆0.5 mL，混匀配成TR浓度分别为1、10、200 ng/mL的标样血浆，按“血浆样品处理”项下操作，按“色谱条件”进样测定，记录TR峰面积，代入随行标准曲线中计算出相应的药物浓度。按此法制备不同天的3个分析批样品，每个浓度做5份样品，分别测定批内和批间的准确度和精密度。

1.2.7 提取回收率  于干净EP管中精密加入不同量的系列TR标准品溶液，再分别加入空白血浆0.5 mL，混匀配成TR浓度分别为1、10、200 ng/mL的标样血浆，按“血浆样品处理”项下操作进行测定，每个浓度做5份样品，记录TR峰面积（Asam）。另取干净EP管中加入空白血浆0.5 mL，按“血浆样品处理”项下操作，然后精密加入不同量的TR标准品溶液，混匀配成TR浓度分别为1、10、200 ng/mL的标样，按“色谱条件”进样测定，记录TR峰面积（Astd），每个浓度做5份样品。血浆中TR提取回收率为：Rec%=Asam/Astd×100% ×N，其中N=5/3(N为萃取液体积校正值)。

1.2.8 血浆样品稳定性  于干净EP管中精密加入不同量的TR标准品溶液，再分别加入空白血浆0.5 mL，混匀配成TR浓度分别为1、200 ng/ml的标样血浆，每个浓度做3份，与犬血浆样品同时放置于﹣80℃冰箱保存。样品测定前取出在室温下融解后按“血浆样品处理”项下操作，测定TR浓度。按此法制备另一批样品，室温放置4 h后按“血浆样品处理”项下操作，测定TR浓度。为考察TR进样时的稳定性，将处理好2种浓度的样品瓶放入自动进样盘中分别于0 h和4 h进样测定，分析比较样品中的TR浓度。

1.2.9 TR在Beagle犬体内的毒代动力学试验  试验设低剂量组（10 μg/kg）、中剂量组（30 μg/kg）、高剂量组（90 μg/kg）3组，每组雌雄各5只。采用经口灌胃给药，连续给药29天。所有犬均在给药前16 h开始禁食不禁水。服药4 h后统一喂食。分别于给药前(0 h)及给药后0.16（10 min）、0.5、1、2、4、8、12 h前肢静脉采集血液约3.0 mL，肝素钠抗凝，离心后分离血浆置已编号标记的EP管，-80℃冰箱保存待测。

1.2.10 数据处理和统计分析  色谱图采用UNIFI软件对样品进行定量处理，用DAS 3.0（(Drug and Statistics)）药代动力学软件对药时数据进行处理和分析，计算AUC及Cmax、Tmax等参数，计算平均值和标准差，并绘制血药浓度-时间（C-T）曲线。

2  结果

2.1  分析方法的验证结果

2.1.1 方法专属性  在本实验条件下，空白溶剂和空白血浆中的杂质不干扰TR样品峰，TR的保留时间为1.48 min（见图1）。说明该方法专属性较高。

 A     空白溶剂色谱图

B  TR标准品（20 ng/mL）色谱图

C      犬空白血浆色谱图 

D 犬空白血浆+TR标准品(4.0 ng/mL)色谱图

图1：A为空白溶剂，B为TR标准品，C为犬空白血浆，D为犬空白血浆+TR标准品

Figure 1  Typical chromatograms of plasma sample spiked with standard triptolide (B), solvent sample (A), blank dog plasma (C), and blank plasma sample add standard triptolide (D)

2.1.2 标准曲线  以血浆TR浓度（X）为横坐标，TR的峰面积（Y）为纵坐标，进行回归运算得标准曲线（图2），其回归方程为Y＝7.6e⁴X＋1.24e⁴（r＝0.9993，n＝6)，线性范围为1.0～200 ng/mL，最低检测浓度为1.0 ng/mL。

2.1.3 准确度、精密度和回收率  在空白血浆中加入TR标样浓度分别为1.0、10.0、200 ng/mL时，批内与批间精密度分别在1.4%~7.9%、5.3%~9.3%之间，准确度分别在87.3%~105.1%、95.4%~97.9%之间（见表1）。当空白血浆中加入TR标样浓度分别为1.0、10.0、200 ng/mL时，回收率分别在（86.9±11.9）%、（99.3±10.6）%、（100.6±11.6）%之间，可见该方法可靠且重复性好。

2.2  血浆样品的稳定性结果

经考察血浆TR浓度（1.0、200 ng/mL）在﹣80℃条件下保存6个月、常温下放置4 h及处理后放置4 h等3种条件下，准确度分别在104.20%～109.50%、94.10%～97.98%、112.25%～103.05%之间，说明在测定条件下样品稳定性良好。

2.3  TR在Beagle犬体内的毒代动力学研究

Beagle犬经口分别灌胃给药10、30、90 μg/kg·d的TR后，血浆TR浓度随时间变化的情况如图2所示。采用DAS 3.0药代动力学软件对血药浓度-时间数据进行分析，以理论浓度值与测得值相关性最好，及AIC最小为判别标准。所得AUC及Cmax、Tmax等参数如表2所示，将各剂量组的T_1/2β、Cmax、Tmax及AUC进行方差分析，结果无统计学差异。采用DAS3.0药代动力学软件对AUC、Cmax进行了多剂量线性分析，AUC在第1天、29天的相关系数分别为0.965、0.967，Cmax在第1天、29天的相关系数分别为0.982、0.986；说明高、中、低剂量组的AUC、Cmax平均值与给药剂量之间存在明显的线性相关。

表1     血浆中雷公藤甲素的精密度和准确度检测结果

Table 1  Accuracy and precision of LC/MS method for determining triptolide concentrations in plasma samples

注：准确度为实测浓度的平均值与添加浓度的比值，精密度为计算所得的RSD%。

表2       给药后各剂量组的毒代参数结果（均数±标准差，n=10）

Table 2  Toxicokinetic parameters in beagle dogs after oral administration of triptolide at different doses

参  数/Parameter

低剂量组

中剂量组

高剂量组

名称/Name

单位/Unit

Low-dose group

Medium-dose group

High-dose group

第1天给药

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