PECAM1、LMOD1基因多态性与动脉粥样硬化斑块易损性的关系研究

李昊文¹，沈宓³，李子瑞¹，张文丽²，王宇新³，高培毅^3,4，王雅杰^2,5

1 首都医科大学附属北京天坛医院国家神经系统疾病临床医学研究中心，北京100070

2 首都医科大学附属北京天坛医院临床医学研究实验室，北京100070

3 首都医科大学附属北京天坛医院神经放射科，北京100070

4 北京市神经外科研究所，北京100070

5 首都医科大学附属北京地坛医院临床检验科，北京100015

基金项目：国家自然科学基金国际合作交流项目（83161120402），国家自然科学基金面上项目（81572474）

摘要：目的 研究PECAM1、MOD1基因多态性位点与中国人群缺血性脑卒中患者颈动脉斑块易损风险的关系。方法 利用Real-time PCR方法，使用TaqMan探针对易损斑块组及稳定斑块组患者PECAM1、MOD1基因多态性位点rs1867624、rs2820315进行基因分型。结果 PECAM1基因rs1867624位点为T/T基因型，LMOD1基因rs2820315位点为C/C基因型的缺血性卒中患者更易形成易损斑块；rs1867624位点为C/C基因型，rs2820315位点为T/T基因型的患者倾向形成稳定斑块。结论 PECAM1、MOD1基因多态性与颈动脉斑块易损性相关，rs1867624位点等位基因T、rs2820315位点等位基因C是形成易损性斑块的风险基因。

关键词：PECAM1，LMOD1，单核苷酸多态性，易损性斑块，缺血性脑卒中

Association between PECAM1, LMOD1 polymorphism and atherosclerotic plaque vulnerability

Abstract: Objective To investigate the correlation between polymorphisms in PECAM1 and MOD1 and plaque vulnerability in ischemic stroke patients. Methods The PECAM1 rs1867624 and MOD1 rs2820315 SNPs were genotyped using TaqMan assays on real-time PCR system. Results Ischemic stroke patients with T/T genotype of PECAM1 rs1867624 and C/C genotype of LMOD1 rs2820315 were likely to form vulnerable plaques. Patients with C/C genotype of rs1867624 and T/T genotype of rs2820315 tended to form stable plaques. Conclusion The polymorphisms of PECAM1 and MOD1 were associated with carotid artery plaque vulnerability. T allele of rs1867624 and C allele of rs2820315 significantly increased the risk of plaque vulnerability.

Key words: PECAM1, LMOD1, single nucleotide polymorphism, vulnerable plaque, ischemic stroke

缺血性脑卒中发病率和致死率高，是世界范围内威胁人类生命健康的重大疾病。在中国，脑卒中发病率呈逐年上升趋势。动脉粥样硬化易损斑块破裂引发的血栓栓塞是缺血性脑卒中的主要致病因素。颅外段颈动脉或颅内动脉血管的粥样硬化斑块均可以导致供血动脉管腔狭窄、血栓形成甚至栓子脱落，从而引发缺血性脑卒中^{[1, 2]}。组织病理学研究结果显示，易损斑块的特点包括管腔表面破裂（disrupted luminal surface，DLS）、斑块内出血（intraplaque hemorrhage，IPH）、附壁血栓（mural thrombosis，MT）等^{[3, 4]}。早期准确识别和评估可能导致缺血事件的易损斑块对于指导临床治疗及卒中预防至关重要。目前迫切需要发掘有效的生物标志物来区分易损型和稳定型动脉粥样硬化斑块的患者^[5]。

单核苷酸多态性（single nucleotide ploymorphism，SNP）是指基因组上单个核苷酸变异所形成的遗传标记，人类许多表型差异、对药物或疾病的易感性都与SNP相关。全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）在全基因组水平通过对大量样本进行SNP等遗传标记的分型分析，从而寻找与复杂疾病相关的遗传基因。已有多项GWAS研究发现了众多与动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、心肌梗塞相关的SNP位点^[6-8]，其中一些位点位于相关的功能基因内部或附近。近年来，研究发现血小板内皮细胞粘附分子1（PECAM1，platelet and endothelial cell adhesion molecule 1）中rs1867624 SNP位点、平滑肌蛋白1（LMOD1，leiomodin 1 ）中rs2820315 SNP位点可能与动脉粥样硬化及主动脉疾病相关^[7]，但它们与动脉粥样硬化斑块易损程度的研究未见报道。

本研究通过对具有颈动脉斑块的缺血性卒中患者PECAM1基因SNP位点rs1867624和LMOD1基因SNP位点rs2820315进行基因分型，研究PECAM1、MOD1基因多态性与中国人群缺血性卒中患者颈动脉斑块易损风险的关系。

1.材料与方法

1.1 受试者信息

    本研究受试者自2014年5月至2017年10月期间从北京天坛医院招募，缺血性脑卒中的存在和严重程度、颈动脉斑块易损性由北京天坛医院神经内科、神经放射科的工作人员评估。本研究共入组受试者270例，其中189例具有易损斑块，81例具有稳定斑块。入组标准为年龄40-85岁，发生于6个月内，经过临床诊断为前循环、非心源性的缺血性脑卒中患者，高分辨率MRI显示具有颈动脉斑块。本研究排除可能为心源性脑卒中、既往颈动脉手术或支架植入、既往颈部放疗、既往肝肾病史及肝移植患者。对所有受试者进行问卷调查，用来判断他们的饮食习惯，是否有吸烟史，是否有卒中的家庭或个人病史、以及既往心脑血管疾病史等。受试者的临床检查包括：常规体格检查及实验室检查，颈动脉高分辨率MRI，颈动脉超声检查。

1.2基因型分析

    抽取病人外周血2 mL，使用血液基因组DNA提取系统（天根生化科技有限公司）提取DNA，方法见试剂盒操作说明书。利用TaqMan探针（Thermo Fisher，Assay ID: C_155066_10及C_1467677_10）分别对PECAM1 rs1867624 和LMOD1 rs2820315 SNP位点进行基因分型。反应体系：DNA模板20 ng，TaqMan SNP Genotyping Assays 0.25 µL，2×TaqMan Genotyping Master Mix（Thermo Fisher）5 µL，补水至10 µL。7500 Fast Real-Time PCR system（Applied Biosystems）仪器进行基因型检测，反应条件如下：95℃ 10 min预变性；95℃ 15 s，60℃ 1 min，重复40个循环。每个SNP位点每种基因型各取2个样本利用测序的方法进行验证。Real-Time PCR方法分型失败的样本利用测序的方法进行分型。

1.3 统计学分析

    利用SPSS 17.0对实验数据进行统计学分析。基因型与Hardy-Weinberg平衡符合程度使用χ²检验，组间基因型及等位基因频率差异比较使用χ²检验。基因型与斑块易损性关系用比值比（odds ratio，OR）及95%置信区间（confidence interval，CI）表示，P < 0.05代表具有统计学差异。

2.结果

2.1 研究对象基本信息

本研究共入组受试者270例（男212例，女58例），对受试者进行颈动脉高分辨MRI分析，其中189例具有易损斑块，81例具有稳定斑块。具有稳定及易损斑块的病人基本临床信息见表1，两组病人体质指数（BMI）、三酰基甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、葡萄糖(Glu)和糖化血红蛋白(GHb)的实验室检测指标没有显著差异。

表1 稳定及易损斑块病人基本临床信息

BMI，体质指数；TG，三酰基甘油；TC， 总胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；Glu，葡萄糖；GHb，糖化血红蛋白。*表示具有统计学差异，P < 0.05。

2.2 PECAM1基因rs1867624位点及LMOD1基因rs2820315位点多态性与斑块易损性关系

经过χ2检验具有稳定斑块及易损斑块的病人组中，rs1867624和rs2820315位点的基因频率和基因型分布比例均达到Hardy-Weinberg平衡（P > 0.05）。

对PECAM1基因rs1867624位点的分析显示：在具有稳定斑块及易损斑块的两组病人中，T/C杂合基因型的病人分别占25.9%和22.2%；T/T纯和基因型的病人分别占66.7%和76.2%，C/C纯和基因型的病人分别占7.4%和1.6%。等位基因T被认为是易损性斑块风险基因，其基因频率在易损斑块组中为87.3%，在稳定斑块组中为79.6%。风险等位基因OR值为1.759 (95% CI = 1.08-2.864, P = 0.022)。

在具有稳定斑块及易损斑块的两组病人中，LMOD1基因rs2820315位点为T/T基因型的病人分别占7.4%和0.5%，C/C基因型的病人分别占69.1%和75.7%。具有易损斑块的病人中C/C基因型所占比例更高，具有稳定斑块的病人中T/T基因型所占比例更高。因此认为等位基因C是易损性斑块的风险基因，其基因频率在易损斑块组中为87.6%，在稳定斑块组中为80.9%，其OR值为1.667 (95% CI = 1.014-2.738, P = 0.042)。

表2. rs1867624 和 rs2820315基因多态性与斑块易损性关系

MAF，最小等位基因频率；OR，比值比；CI，置信区间。*表示具有统计学差异，P < 0.05。

3.讨论

    单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。SNP做为第三代遗传标志，在疾病高危群体发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和实验中提供强有力的工具。全基因组关联研究（GWAS）是指在全基因组层面上，通过对大规模的群体DNA样本进行SNP等高密度遗传标记分型，从而寻找与复杂疾病相关的遗传基因。近年来，多项GWAS研究通过高通量测序和DNA微阵列技术，发现了数十个甚至上百个与动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、心肌梗塞相关的SNP位点^[6-8]。多项独立的实验证实一些基因的多态性与动脉粥样硬化高度相关，如CDKN2A/2B、ADAMTS7、PHACTR1、SH2B3、COL4A1/2等^{[6, 9-12]}。然而，GWAS数据通常有较高的假阳性，并且许多GWAS研究是基于欧洲人群，基于亚洲人群的研究相对较少。由于人种间基因构成的差异，一些在欧洲人群中发现的动脉粥样硬化易感位点在中国人群中无法直接应用。例如，东亚人群中9p21.3、SORT1、PDGFD的OR值均小于欧洲人群^[6]。因此，在使用来自欧洲人群的GWAS数据前，我们首先需要在中国人群中进行广泛验证。

2017年，研究人员通过基因芯片及meta分析，发现了15个与冠状动脉疾病相关的基因多态性新位点，这些位点位于与动脉粥样硬化及主动脉疾病相关的功能基因附近，如细胞粘附、白细胞迁移和动脉粥样硬化相关的PECAM1基因、与凝血和炎症相关的PROCR基因、与血管平滑肌细胞分化相关的LMOD1基因等^[7]。PECAM1参与维持血管屏障的完整性，血管屏障功能损伤会导致动脉粥样硬化等慢性炎性疾病的发生^[13]。实验证明表达PECAM1的内皮细胞血管屏障完整性恢复更快^[14]，此外，PECAM1表达能够增加小鼠动脉粥样硬化易感区域斑块负载^[15]并减小主动脉的动脉粥样硬化区域^[16]。因此，PECAM1作为一种候选基因与主动脉疾病的发生密切相关。LMOD1在动脉血管壁等富含平滑肌的组织中高度表达^[17]，敲除LMOD1基因会导致主动脉平滑肌细胞增殖及迁移能力加强、收缩能力受损。研究显示LMOD1在维持平滑肌分化状态中起了关键作用^[18]。LMOD1基因多态性变化可能导致该基因在平滑肌细胞中的表达或功能紊乱，从而提高主动脉疾病的遗传风险。

Rs1867624 SNP位点位于PECAM1基因上游，rs2820315SNP位点位于LMOD1基因内含子区域。这两个基因多态性位点均处于基因的非编码区域，关于它们引起动脉粥样硬化斑块易损性变化的机制尚不明确。推测它们可能影响基因表达水平，或者仅仅作为与疾病关联表达的遗传位点。本研究通过对具有易损斑块和稳定斑块的两组缺血性脑卒中患者进行基因分型，发现PECAM1基因rs1867624位点等位基因T、LMOD1基因rs2820315位点等位基因C是形成易损性斑块的风险基因。PECAM1基因rs1867624位点为T/T基因型，LMOD1基因rs2820315位点为C/C基因型更易形成易损斑块；PECAM1基因rs1867624位点为C/C基因型，LMOD1基因rs2820315位点T/T基因型倾向形成稳定斑块。本研究揭示PECAM1、LMOD1基因多态性与中国人群缺血性卒中患者颈动脉斑块易损风险相关，但这些基因多态性的具体功能和作用机制还需要进一步研究。

本研究的局限性在于：由于入组条件比较严格（病人患有缺血性脑卒中，具有颈动脉斑块，且经过高分辨MRI及B超检查），入组的患者数量相对较少。大样本量使我们能够找到疾病相关的微效基因，但这些微效基因往往没有显著的临床意义。在本研究中，由于样本量较小，更容易寻找到与真实的临床疾病相关性强的关键基因。我们计划未来继续收集临床病人,丰富实验样本库,对研究结果进行验证和完善，并发掘更多有意义的与缺血性脑卒中及动脉粥样硬化斑块稳定性相关的SNP位点。

参考文献

1. Spacek, M., et al., Vulnerable atherosclerotic plaque - a review of current concepts and advanced imaging. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, 2018. 162(1): p. 10-17.

2. Yurdagul, A., Jr., et al., Mechanisms and Consequences of Defective Efferocytosis in Atherosclerosis. Front Cardiovasc Med, 2018. 4: p. 86-95.

3. Sun, R., et al., Carotid Atherosclerotic Plaque Features in Patients with Acute Ischemic Stroke. World Neurosurg, 2018. 112: p. e223-e228.

4. Naghavi, M., et al., From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation, 2003. 108(14): p. 1664-1672.

5. Hellings, W.E., et al., From vulnerable plaque to vulnerable patient: the search for biomarkers of plaque destabilization. Trends Cardiovasc Med, 2007. 17(5): p. 162-171.

6. McPherson, R. and A. Tybjaerg-Hansen, Genetics of Coronary Artery Disease. Circ Res, 2016. 118(4): p. 564-578.

7. Howson, J.M.M., et al., Fifteen new risk loci for coronary artery disease highlight arterial-wall-specific mechanisms. Nat Genet, 2017. 49(7): p. 1113-1119.

8. van der Harst, P. and N. Verweij, Identification of 64 Novel Genetic Loci Provides an Expanded View on the Genetic Architecture of Coronary Artery Disease. Circ Res, 2018. 122(3): p. 433-443.

9. van Setten, J., et al., Genome-wide association study of coronary and aortic calcification implicates risk loci for coronary artery disease and myocardial infarction. Atherosclerosis, 2013. 228(2): p. 400-405.

10. Ozaki, K. and T. Tanaka, Molecular genetics of coronary artery disease. J Hum Genet, 2016. 61(1): p. 71-77.

11. Dichgans, M., et al., Shared genetic susceptibility to ischemic stroke and coronary artery disease: a genome-wide analysis of common variants. Stroke, 2014. 45(1): p. 24-36.

12. Lee, J.Y., et al., A genome-wide association study of a coronary artery disease risk variant. J Hum Genet, 2013. 58(3): p. 120-126.

13. Ren, Q., et al., Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM1) plays a critical role in the maintenance of human vascular endothelial barrier function. Cell Biochem Funct, 2015. 33(8): p. 560-565.

14. Privratsky, J.R., et al., Relative contribution of PECAM-1 adhesion and signaling to the maintenance of vascular integrity. J Cell Sci, 2011. 124(Pt 9): p. 1477-1485.

15. Harry, B.L., et al., Endothelial cell PECAM-1 promotes atherosclerotic lesions in areas of disturbed flow in ApoE-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008. 28(11): p. 2003-2008.

16. Goel, R., et al., Site-specific effects of PECAM-1 on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008. 28(11): p. 1996-2002.

17. Nanda, V. and J.M. Miano, Leiomodin 1, a new serum response factor-dependent target gene expressed preferentially in differentiated smooth muscle cells. J Biol Chem, 2012. 287(4): p. 2459-2467.

18. Halim, D., et al., Loss of LMOD1 impairs smooth muscle cytocontractility and causes megacystis microcolon intestinal hypoperistalsis syndrome in humans and mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017. 114(13): p. E2739-E2747.