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一株高效解钾菌的筛选鉴定及其对烟叶吸收钾和磷特性研究
吴俊林，李翔1，栗卫华1，毕乐乐2，冯国胜1，王红保1，周权1，郝浩浩1**，刘建丰3，贾峰4
（驻马店市烟草公司泌阳县分公司，河南 泌阳463700；2. 华环国际烟草有限公安徽 凤阳 233121；3.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所，河南 郑州450002；4. 河南工业大学生物工程学院，河南 郑州 450001）
摘要：
本研究以驻马店泌阳植烟区土壤为原料，从中筛选与鉴定了一株高效的解钾菌并对其实验室和烟田进行了解钾和溶磷试验，结果表明：该分离出的解钾菌为不动杆菌，实验室验证该菌株的解钾和溶磷能力比较强；对烟草大田试验表明，解钾菌能够有效分解土壤中的全钾，供烟草吸收和生长需要，对烤烟烟叶中钾含量的吸收和利用有协调促进作用，对烤烟植株的生长有明显的促进作用，从而提高烟田的烟叶的产量和质量，有利于增加植烟的经济效益。
关键词：解钾菌；筛选；烟叶；钾吸收；磷吸收
中图分类号 S572 文献标志码 A 文章编号
Screening and Identification of a High Efficiency Potassium Bacterium and
Its Effect on Potassium and Phosphorus Uptake in Tobacco
WU Junlin1, LI Xiang1, LI Weihua1, BI Lele2, FENG Guosheng1, WANG Hongbao1, ZHOU Quan1, HAO Haohao1*, LIU Jianfeng3, JIA Feng4
(1. Biyang Branch of Zhumadian Tobacco Company, Biyang 463700, China;
2. Huahuan International Tobacco Co., Ltd., Fengyang 233121, China;
3. Agricultural Economy & Information Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450001, China; 4. College of Bioengineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)
Abstract: This work aimed at to screen and identify a highly effective potassium bacterium from the soil of tobacco planting area at Biyang in Zhumadian city. Then it was used to understand the potassium and phosphorus solubilization in the laboratory and tobacco field. The results showed that the isolated bacterium was Acinetobacter acinetobacter. The ability of potassium and phosphorus solubilization of the strain was stronger than others in laboratory. The experiment on tobacco field showed that potassium bacteria could effectively decompose the total potassium in soil for the need of tobacco absorption and growth. It could promote the absorption and utilization of potassium content in flue-cured tobacco leaves and obviously promote the growth of flue-cured tobacco plants. In order to improve the yield and quality of tobacco field, thus increasing the income of tobacco farmers.
Keywords: Potassium bacteria; Screening; Flue cured tobacco; Potassium absorption; Phosphorus absorption
研究表明在烟叶生长过程中，河南驻马店的泌阳植烟土壤里存在大量的缓效钾和缓效磷，但不能被烟草吸收和利用[1]，这是造成烟叶中钾含量较低的原因之一。
前期研究表明，目前，一方面随着大量化肥的施用，特别是多施氮磷、不施或少施钾肥，使得北方土壤的缺钾现象越来越严重[2]，另一方面土壤中的钾含量丰富，但95%的钾为矿物钾形态，可供植物吸收利用的速效钾不超过2%[3]。微生物解钾菌能够实现矿物钾的生物有效化利用，在延边、云南、福建以及河南烟区都能够分离出解钾菌，对烟草的生长和最终的经济收入相关[4-7]。
解钾菌又称硅酸盐细菌，是一类可以分解土壤中的硅酸盐如钾长石和云母等矿物，将难溶性的钾、磷、硅转变为可溶性状态供植物吸收利用的一类微生物，有研究表明解钾菌分泌有机酸是溶解硅酸盐矿物并释钾的主要原理[8]。解钾菌产生了特殊的酶能破坏矿物晶格的结构或是因为其表面的物化作用而使钾释放出来[9, 10]。菌株能够分泌大量相对分子质量小的有机酸和大量胞外多糖，胞外多糖可将解钾菌与矿物包埋在一起使矿物表面的有机酸浓度大大增加，从而使矿物中的钾被释放出来[11]。也有学者提出了细菌矿物复合体综合作用假说：细菌通过表面多糖与矿物质形成细菌矿物复合体；细菌对矿物表面疏松部位产生溶蚀作用；溶蚀后的小颗粒包裹在有机质中使接触面增大，加剧溶蚀作用；复合体微环境发生改变如有机酸富集、氧化还原电位变化；溶蚀进一步进行，矿物颗粒晶格发生形变或崩解，在氢离子的帮助下，钾离子释放；细菌吸收钾离子促进钾离子的进一步释放[12]。
磷是DNA、RNA、ATP和磷酸类脂等生命大分子的重要组成部分，也是植物生长发育的关键物质[13-16]，土壤中磷浓度成为土壤肥力的最重要的限制性因素之一[17, 18]。解钾菌一般也有溶出土壤中不溶性矿物磷，提高土壤磷肥力[19, 20]。溶磷微生物肥料的施用，能够缓解长期施用化学肥料引起的土壤板结等问题，而高效、稳定的溶磷菌株的获取，是构建微生物磷肥的关键[21-25]。
本实验通过从植烟土壤中分离出的解钾菌，观察其形态特征，培养该菌种进行植烟土壤的喷施，检测其解钾和溶磷效果及其对大田烟草的生长和烟叶中钾和磷含量的影响，分析高效菌种与烟草根系的互作关系，为进一步理解烟草根际微生物群落的互作机理、为有效推广和利用高效菌种、强化烟叶特色提供技术支撑。以期为利用微生物菌肥解决河南烟区烟叶钾含量偏低问题及微生物菌肥的开发和利用提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 菌种来源
菌种来自驻马店泌阳烟区植烟根际土壤分离，由河南工业大学河南省工业微生物菌种保藏与选育工程实验室选育、保藏和提供。
1.2菌体和菌落形态结构观察
将菌株划线分离，形成单菌落。接种于LB中37℃ 200 rpm 培养16-18 h。于对数生长期进行革兰氏染色观察。 接种于硅酸盐细菌培养基培养，28℃培养7 d，观察菌落形态。
1.3钾溶液标准曲线的绘制
采用火焰分光光度计测定钾溶液的浓度和Abs，绘制钾溶液的标准曲线。准确称取恒重的0.1910 g氯化钾溶解到100 mL的容量瓶中，钾浓度为1000 μg/mL，分别准确稀释到1μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL、4 μg/mL进行检测。
1.4 解钾菌的溶磷能力检测
菌液的培养条件参考屈建航等[26]方法，溶液中磷含量的检测采用钼蓝比色法[16]，培养液pH值检测采用PHS–3C酸度计，采用无菌培养液代替菌液作为实验对照。
1.5 解钾菌制备
将解钾菌BYT-1接种与LB液体培养基中，37℃，200 rpm摇瓶培养至对数生长末期，直接采用培养基备用。试验在河南省驻马店市烟草公司泌阳分公司实验田进行，每个小区面积为266.8 m2。K肥施用量是常规施肥的80%，每个处理重复3次，按随机区组排列，常规施肥，清水处理作为对照。配置解钾菌处理为高、中、低三个：用量分别采用：2.5 L/667m2、5.0 L/667m2、7.5 L/667m2。移栽前土壤理化性质分析结果见吴风光等方法[27]。烤烟品种为云烟87，分别于旺长期和打顶后进行烤烟农艺性状情况调查，取烤烟根际土壤测定微生物数量，对圆顶期土壤进行全面理化性质分析。取样均采用5 点取样法。
1.6 土壤微生物数量测定
细菌计数采用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌计数采用改良高氏一号培养基，真菌计数采用马丁氏培养基，解钾菌计数采用硅酸盐细菌培养基。
1.7 土壤化学成分的检测
土壤中全氮、全磷、全钾、水解性氮、有效磷、速效钾含量的测定，分别采用土壤全氮的测定法NY/T 1121.24-2012、土壤全磷测定法NY/T 88-1988、土壤全钾测定法NY/T 87-1988、森林土壤氮的测定LY/T 1228-2015（4）、土壤有效磷的测定NY/T 1121.7-2014和土壤速效钾和缓效钾含量的测定NY/T 889-2004。
1.8 烟叶中化学成分的检测
烟叶中检测指标：全氮（植株全氮含量测定自动定氮仪法、NY/T 2419-2013）、全钾（植株全钾含量测定火焰光度计法、NY/T 2420-2013）、全磷（植株磷含量测定紫外分光光度计法、NY/T 2421-2013）、总烟碱（烟草及烟草制品烟碱的测定气相色谱法、YC/T 246-2008）。
2 结果与分析
2.1 解钾菌的形态鉴定
经过2 d培养，如图1所示，分离得到的BYT-1株菌落的形态，乳白色、不透明，边缘整齐，表面光滑，无弹性不能成丝，较耐高温，有臭味。菌体革兰氏染色呈阴性，链珠状，为不动杆菌。
图1. 解钾菌BYT-1菌落的形态（A）和40倍显微镜观察特征（B）
2.3 解钾菌溶液中钾离子浓度的检测
在亚历山德罗夫培养液体培养基中经过4天培养测定溶液中钾含量，通过标准曲线得出吸光度和浓度之间的关系：y=0.1641x，R2=0.9973，以此为基准方程，根据待测样品的吸光度测量出BYT-1的浓度，CK处理的钾离子浓度为0.127 μg/mL，BYT-1处理的钾离子浓度为4.951 μg/mL，处理显著高于对照，解钾菌培养时间越长，溶液中钾离子浓度越大，且处理也显著高于对照。
解钾菌菌株的溶磷曲线见图2所示，结果表明，菌种的溶磷曲线表现为30h之前较为缓慢；30-100 h时溶磷效果较快，在培养70 h时无机磷培养基中的磷含量到达10.1 μmol/mL，到达最高值；随后有所下降。培养液中的pH值变化为在30 h之前pH下降较缓慢，30-70 h之间pH值下降与溶液中磷浓度呈负相关，随着磷含量的上升，pH值不断下降，在70 h时达到3.8 ，随后不断上升至5.5左右。
烟草土壤喷施解钾菌对植烟土壤中解钾菌和微生物总量的影响如图3所示，由图3可以看出，随着解钾菌处理浓度的增加，土壤中解钾菌的数量也不断地增加，由对照的1.7×103个/g增加了2.38倍，达到4.05×103个/g；土壤中微生物总量也有增加，由对照的1.345×106个/g增加了1.59倍达到2.145×106个/g。表明土壤中增施该菌液，能够有效增加土壤微生物总量，可能与该菌具有较友好的共处有关，也可能与喷施菌液中的营养成分是增加微生物总量的原因。
烟草土壤喷施解钾菌对植烟土壤主要矿质元素含量的影响如表1所示，由表1可以看出，喷施解钾菌的处理对土壤中的全氮和全磷的含量影响不显著；解钾菌随着菌液浓度的增加，处理后土壤中的全钾含量随着浓度的增加而显著低于对照，表明解钾菌对烟株根系周围的土壤中的全钾能够有效的降解；喷施解钾菌能够降低植烟土壤中的有效磷含量，但与菌液的浓度不成正比，可能与解钾菌在解磷时的机理比较复杂有关；喷施解钾菌对植烟土壤中的水解性氮的含量均影响不显著，可能与解钾菌对氮元素的分解有局限性；喷施解钾菌随着菌液的浓度增加，植烟土壤中的速效钾含量比对照含量相比显著升高，表明与解钾菌的分解全钾的能力呈正相关。
|
处理 |
全氮 |
全磷 |
全钾 |
有效磷 |
水解性氮 |
速效钾 |
|
（g/kg） |
（g/kg） |
（%） |
（mg/kg） |
（mg/kg） |
（mg/kg） |
|
|
CK |
0.963 b |
0.461 a |
1.34a |
27.75 a |
132.00a |
147.50 d |
|
低浓度 |
1.090 ab |
0.455 a |
1.31 a |
23.75 ab |
119.00 a |
259.00 c |
|
中浓度 |
1.105 a |
0.465a |
1.26 ab |
27.90a |
133.50 a |
340.00b |
|
高浓度 |
0.955 b |
0.446 a |
1.21 b |
21.15 b |
135.00 a |
472.00 a |
2.7 解钾菌对烟草生长的影响
烟草土壤喷施解钾菌后对烟草生长期的影响如表2所示，由表2可以看出，喷施解钾菌随着菌液浓度的增加，在旺长期烟草株高显著高于对照处理，表明解钾菌能够有效促使烟草植株的高度生长；喷施解钾菌对烟草的叶数的增加表现显著，而喷施解钾菌对烟草叶数的增加，与对照的差异均不显著；喷施解钾菌对烟草的最大叶长的增加表现显著，而喷施解磷菌对烟草最大叶长的增加，与对照和其他两个处理的差异均不显著；喷施解钾菌对烟草的最大叶宽的增加表现显著。喷施解钾菌的处理烟草在打顶后，株高也显著高于对照处理；烟草叶片数量显著减少，这与前期采摘成熟的烟叶较多有关；对烟草的最大叶长和叶宽的增加表现不显著，与对照处理的差异均不显著。
|
处理 |
旺长期 |
中后期 |
||||||
|
株高 |
叶数 |
最大叶长 |
最大叶宽 |
株高 |
叶数 |
最大叶长 |
最大叶宽 |
|
|
CK |
110.17 b |
17.33 b |
58.75b |
27.67 b |
113.33 b |
12.50 b |
72.92 a |
33.08a |
|
低浓度 |
115.00 b |
18.83 a |
63.92 ab |
33.08 a |
115.83 b |
11.83 bc |
68.50 a |
28.67 a |
|
中浓度 |
123.17 a |
18.67 a |
62.58 ab |
27.42 b |
123.67 a |
11.00 c |
73.33a |
31.50 a |
|
高浓度 |
123.33 a |
18.33 ab |
67.58 a |
32.83 a |
124.33 a |
14.17 a |
73.08 a |
33.25 a |
解钾菌对烤后烟叶中主要理化指标及其产量的影响结果见表3，由表3可以看出，喷施解钾菌随着菌液浓度的增加，对烤烟烟叶中全磷和全钾含量的影响有显著增加；喷施解钾菌随着菌液浓度的增加对烤烟烟叶中的全氮、氯及总烟碱的含量影响均不显著，虽然喷施解钾菌能够降低烤烟烟叶中氯和总烟碱的含量，但降低效果不显著；喷施解钾菌处理能够提高烤烟的产量，随着菌液浓度的增加，烟叶的总量由95.2kg，提高到105.9 kg，提高烟叶的重量10.7 kg。
表 3 解磷菌对烤后烟叶中主要理化指标及其产量的影响
|
处理 |
全氮 |
全磷 |
全钾 |
氯 |
总烟碱 |
产量 |
|
（g/kg） |
（g/kg） |
（g/kg） |
（%） |
（μg/g） |
(kg) |
|
|
CK |
15.70 a |
1.80b |
13.15 c |
0.53 a |
518.00 a |
95.2c |
|
低浓度 |
17.13 a |
2.03 ab |
15.13 b |
0.53 a |
492.67 a |
96.6c |
|
中浓度 |
17.83 a |
2.42 a |
18.47 a |
0.49 a |
668.00 a |
100.9b |
|
高浓度 |
17.10 a |
2.19 ab |
18.53 a |
0.49 a |
457.67 a |
105.9a |
3 结论
对解钾菌的鉴定表明，本试验结果分离出的解钾菌为不动杆菌，实验室验证该菌株的解钾和溶磷能力比较强。利用该解钾菌在驻马店泌阳烟草大田试验表明，该菌能够有效分解土壤中的全钾，供烟草吸收和生长需要，对烤烟烟叶中钾含量的吸收和利用有协调促进作用，对烤烟植株的生长有明显的促进作用，从而提高烟田的烟叶的产量和质量，有利于提高植烟的经济效益。
参考文献
[1] 吴俊林, 王璀璨, 毕乐乐, 等. 增施叶面钾肥对烤烟烟叶钾积累和利用的研究[J]. 农技服务, 2017, 34(5):16-18.
[2] 党雯, 郜春花, 张强, 等. 解钾菌的研究进展及其在农业生产中的应用[J]. 山西农业科学, 2014, 42(8):921-924.
[3] 连宾. 硅酸盐细菌的解钾作用研究[M]. 贵阳: 贵州科技出版社.1998:
[4] 张书泰, 杨秋明, 陈钦, 等. 福建南平不同植烟土壤微生物数量与养分状况分析[J]. 中国农学通报, 2014, 30(31):76-81.
