Effects and mechanisms of tetrandrine derived HL-22 on human breast cancer cell line MDA-MB-435 proliferation

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，以绝经期妇女最为常见。据报道，乳腺癌发病率仅次于肺癌，全球每年约有 20 万的女性被诊断为浸润性乳腺癌，给妇女健康及人类社会经济带来极大危害^[1]。当前，癌症治疗主要是放射性治疗、化学药物治疗或者两者结合，其主要原理是抑制DNA复制或细胞分裂从而达到癌细胞不能增殖， 进而诱导癌症细胞死亡^[2] 。乳腺癌的临床治疗以手术为主，术后的放化疗能有效的防止局部复发和远处转移。尽管如此，乳腺癌的预后仍不乐观，如何有效改善乳腺癌的预后仍面临巨大的挑战^[3]。近年来，改善癌症治疗的重点是开发具有更多选择性的生物学方法以克服肿瘤细胞的抗药性，尽量减少药物毒副作用^[4]。因此寻找广谱并且毒副作用小的抗肿瘤药物已迫在眉睫。

研究表明，汉防己甲素是一种多靶点的抗肿瘤天然物质。汉防己甲素(tetrandrine, Tet)对乳腺癌细胞也具有抑制增殖和促进凋亡的作用，机制可能与抑制PKC-α和逆转耐药等有关，但具体分子机制仍不十分清楚^[5-7]。 汉防己甲素也是一种心脏低毒性的钙通道拮抗剂,在体内外都有较好的白血病细胞耐药逆转作用, 其耐药逆转机制不仅是下调MDR1 mRNA/P-gp 的表达和引起细胞内抗癌药物的积聚, 还有增加抗癌药物致细胞凋亡等方面的作用^[8-9]。RECQl、WRN、BLM、RECQ4和RECQ5是存在于人体的五种重要的RecQ解旋酶家族成员，布卢姆综合征(BLM)基因是Recq DNA解螺旋酶家族成员之一，其缺乏或突变可导致细胞发生癌变或凋亡^[10]，翟晓东的研究表明RecQ1可能成为判断人脑胶质细胞瘤恶性程度或预后的新指标，并可能成为胶质瘤的基因治疗的新靶点^[11]；同时默董亮的结果充分说明了RecQL4可做为癌症化疗中一个潜在的应用靶点，同时揭示了RecQL4-AKT-YB1-MDR1这一调节轴心在胃癌对顺铂耐药性机制中发挥了重要作用^[12]；以上研究结果均提示RecQ解旋酶将有望成为肿瘤诊断标志或肿瘤治疗的新靶点。本科研研究用的小分子化合物HL-22是一种汉防己甲素的新型衍生物，它是以BLM解旋酶作为靶标来筛选的抗肿瘤药物，鉴于此，本研究运用MTT法、细胞集落形成法和活细胞计数法检测小分子化合物HL-22对乳腺癌细胞系MDA-MB-435细胞株生长的抑制作用，并利用RT-PCR实验检测BLM解旋酶基因mRNA水平，探讨HL-22影响肿瘤细胞增殖的作用机制，对阐明其与BLM解旋酶作用的分子机制具有一定意义，为进一步对该小分子物质进行抗癌研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

   恶性肿瘤细胞：乳腺癌细胞系MDA-MB-435                

正常细胞对照组：脐静脉内皮细胞Huvecs

汉防己甲素衍生物：HL-22

1.2 药物与试剂

(1) HL-22：称取3.4 mg HL-22，溶解于229 µL DMSO中，配制成20 mmol/L HL-22溶液，于-20℃下保存，使用时用ddH₂O稀释至所需工作浓度(2) 完全高糖DMEM培养基：高糖DMEM基础培养基88 mL，0.2mol/L谷氨酰胺1 mL，双抗溶液1 mL，小牛血清10 mL，用5.6% NaHCO₃溶液调节pH值使其达到7.2～7.4。(3) 胎牛血清、超级新生牛血清(杭州四季青)(4) 0.25%胰蛋白酶 (Hyclone公司)

(2) 按照参考文献^[13]合成引物：北京鼎国生物技术有限公司合成

上游引物序列: 5′-GGATCCTG-GTTCCGTCCGC-3′

下游引物序列: 5′-CCTCAGT-CAAATCTATTTGCTCG-3′扩增产物长度为708 bp，

内参照为β-actin上游引物序列: 5′-CGGAGTCAA-CGGATTTGGTCGTAT-3′，

下游引物5′-AGCCTTCTC-GATGGTGGTGAAGAC-3′，扩增产物长度为306 bp

(3) 总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)

1.3仪器

Nikon 倒置显微镜 Nikon 正置显微镜(日本 Nikon 公司)Eppendorf 梯度PCR仪 (德国Eppendorf公司) DYCZ-24DN型迷你垂直电泳仪( 北京市六一仪器厂)

CO₂培养箱 (美国Thermo)超净工作台 (苏州净化设备有限公司)        

1.4方法                                 

1.4.1 MTT实验

   用含10％胎小牛血清配置的完全培养液配成单个细胞悬液，以每孔8000个细胞接种到96孔板，每孔体积100 μL，放置CO₂培养箱培养12小时，使MDA-MB-435细胞完全贴壁。 每孔加入用无血清培养基稀释好的药物，每孔体积100 μL，使得药物终浓度达到0.50 μmol/L、2.5 μmol/L 、5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L。同时设置阴性对照孔和含1.5%DMSO培养基的对照孔。 细胞加药培养24小时、48小时和72小时后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 ul，避光放置CO₂培养箱4小时。每孔加150 μL DMSO，10分钟。 在设置界面，设计好检测文档，选用490 nm的测定波长在酶标仪上测每孔光吸收值，把结果保存到文档里。 抑制率(％)=(1-用药组OD值／阴性对照组OD值)×100%。使用 SPSS 11．0 进行配对t检验对各种药物浓度组与没有加药组的OD值的统计学比较，实验数据OD值以均数±标准差(x±s)表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

 1.4.2 细胞集落形成实验

 取对数生长期贴壁细胞一瓶，经EDTA液消化后做成单个分散细胞悬液，台盼蓝染色作活细胞计数，用生长培养基稀释成每毫升700个细胞。取24孔板，每3个一组，各加受试药物10 μL，使得药物终浓度达到0.5 μmol/L、2.5 μmol/L和5 μmol/L。稀释后的细胞悬液每孔加0.5 mL，混匀后在含5%CO2的37℃温箱中静置7天。 弃去培养液，用PBS洗3次，形成的集落用甲醇固定，然后用台盼蓝染色，参照对照组看细胞的存活率，克隆形成率和集落抑制率。

 克隆形成率=（）100%

 集落抑制率=（1—）100%

 1.4.3 半定量RT-PCR实验

 RNA的提取（采用天根生化科技有限公司RNA提取试剂盒提取RNA），然后逆转录反应　(M-MLV第一链合成系统试剂盒是向inventgen公司购买)接着 PCR扩增和PCR产物分析，最后是统计学处理 使用SPSS 17.0进行独立样本的t检验对各组数据进行统计学比较，实验数据比值都以均数±标准差(x±s)表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 研究结果

2.1 HL-22对乳腺癌细胞系MDA-MB-435的生长抑制作用研究

采用MTT实验检测HL-22对乳腺癌细胞系MDA-MB-435生长的影响，结果发现，HL-22作用细胞24小时、48小时和72小时，5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L剂量组的细胞增殖抑制率与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)，呈剂量依赖关系，25μmol/L和50μmol/L剂量组在作用细胞24小时后的抑制率可达90%以上(见图11)。

HL-22对MDA-MB-435细胞作用24小时、48小时和72小时的IC50值分别为5 μmol/L、2.7 μmol/L、4.3 μmol/L；而阳性对照药物MMC对MDA-MB-435细胞作用24小时、48小时和72小时的IC50值分别为30.9 μmol/L、7 μmol/L、4.9 μmol/L。

图11 HL-22对MDA-MB-435细胞生长的影响

注：与HL-22(0 µmol/L)组比较，“*”: P＜0.05;  “**”: P＜0.01

Fig.11 Effects of HL-22 on the growth of MDA-MB-435 cell

Note: “*”P＜0.05, “**”P＜0.01; compared with HL-22(0 µmol/L)

2.2采用细胞集落形成实验检测HL-22对乳腺癌细胞系MDA-MB-435集落形成的影响，结果发现，对照组集落形成率为50%，对照组集落形成率在（40%-60%）之间说明细胞生长状况良好；当HL-22浓度为0.5 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L时，其对MDA-MB-435细胞的集落抑制率都为100%。结果见图12、图13。

图12 HL-22对MDA-MB-435细胞集落形成的影响

注：与HL-22 (0 μmol/L)组比较，*P<0.01

Fig.12 Effects of HL-22 on the colony formation of MDA-MB-435 cell

Note: *P<0.01, compared with HL-22 (0 μmol/L)

图13 HL-22作用于MDA-MB-435细胞形成的集落（400×）（台盼蓝染色）

A: 0μmol/L   B: 0.5μmol/L ；C:2.5μmol/L ；D: 5μmol/L 

Fig.13 HL-22 effect on MDA - MB - 435 cell colony formation

A: 0μmol/L   B: 0.5μmol/L；C:2.5μmol/L ；D: 5μmol/L  

采用活细胞计数实验检测HL-22对乳腺癌细胞系MDA-MB-435生长的影响， 研究发现，与阳性对照相同，HL-22浓度为0.5 µmol/L时即能明显抑制MDA-MB-435细胞的生长，抑制率为99.8%；而当HL-22浓度达到2.5 µmol/L时，MDA-MB-43B细胞的存活率为0（见表3）。

表3 HL-22对MDA-MB-435细胞生长的影响

Tab.3 Effects of HL-22 on the growth of MDA-MB-435 cell

药物（µmol/L）              N1（个）               N2（个）

0                       7740±436               7740±436          0.5                        6±1*                 10±2*          2.5                         0*                    0*          5                           0*                    0*

注：N1：MMC作用下细胞存活数；N2：HL-22作用下细胞存活数；与HL-22 (0 μmol/L)组比较，*P<0.01

Note: N1 is the number of survival cells induced by MMC; N2 is the number of survival cells induced by HL-22; *P<0.01, compared with HL-22 (0 μmol/L)

2.3 HL-22对乳腺癌细胞系MDA-MB-435 BLM mRNA水平影响的研究

采用RT-PCR实验检测HL-22作用于MDA-MB-435细胞24 h后BLM mRNA的水平。由图20和图21可以看出，BLM mRNA在MDA-MB-435细胞中表达显著高于正常脐静脉内皮细胞(P<0. 05)； HL-22作用于MDA-MB-435细胞24 h后， 10μmol/L剂量组中BLM mRNA水平明显高于0μmol/L剂量组(P<0. 01)，5μmol/L剂量组中BLM mRNA水平明显高于0μmol/L剂量组(P<0. 05)。

                    

图20 HL-22：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L剂量组诱导 MDA-MB-435和HUVEC细胞后BLM蛋白的表达水平M：DNA MARKER(II)，泳道1：MDA-MB-435 (10μmol/L).泳道2: MDA-MB-435 (5μmol/L). 泳道3: MDA-MB-435 (2.5μmol/L). 泳道4: MDA-MB-435 (0μmol/L).泳道5:HUVEC(0μmol/L)

Figure.20 BLM expression level of MDA-MB-435 and HUVEC induced by HL-22 for 2.5μmol/L，5μmol/L and 10μmol/L. M:marker(II).Lane1:MDA-MB-435 (10μmol/L). Lane2: MDA-MB-435 (5μmol/L).Lane3:MDA-MB-435(2.5μmol/L).Lane4:MDA-MB-435

(0μmol/L).Lane5:HUVEC(0μmol/L)

图21  BLM mRNA的表达水平（灰度值比率）灰度值的比较采用的是Gel-Pro Analyzer软件分析1:MDA-MB-435 (10μmol/L). 2: MDA-MB-435 (5μmol/L). 3: MDA-MB-435 (2.5μmol/L). 4: MDA-MB-435 (0μmol/L).5:HUVEC(0μmol/L) . **P<0.01 MDA-MB-435 (10μmol/L)同 MDA-MB-435 (0μmol/L)细胞比较具有统计学意义.

*P <0.05 MDA-MB-435 (5μmol/L)同 MDA-MB-435 (0μmol/L)细胞比较具有统计学意义

^#P <0.05 MDA-MB-435(0μmol/L)同HUVECS(0μmol/L)细胞比较具有统计学意义

Figure 21 expression levels of BLM mRNA (optical density ratio). 1:MDA-MB-435 (10μmol/L). 2: MDA-MB-435(5μmol/L).3:MDA-MB-435(2.5μmol/L).4:MDA-MB-435(0μmol/L).5:HUVEC

** P<0.01 MDA-MB-435 (10μmol/L) compared with MDA-MB-435 (0μmol/L)

*P <0.05 MDA-MB-435 (5μmol/L) compared with MDA-MB-435 (0μmol/L)

^# P <0.05 MDA-MB-435 (0μmol/L) compared with HUVECS (0μmol/L)

3 讨论

汉防己甲素又名粉防己碱，是从防己科植物粉防己的块根中提取出来的一种双苄基异喹啉类生物碱。丁巍等发现了汉防己甲素对人肺腺癌细胞有放射增敏作用^[14] ，李忠孝等运用汉防己甲素联合阿霉素体外逆转了前列腺癌细胞耐药性^[15] ，还有吴翱兰等发现了汉防己甲素衍生物对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用^[16] ，这些研究表明汉防己甲素具有广泛的药理学作用，特别是在抗肿瘤方面发挥极大的药理作用，它具有镇痛、降血压、抗风湿、抗纤维化、抗炎性反应、抗肿瘤等作用^[17]。研究表明，Tet抑制与杀伤肿瘤细胞机制包括诱导细胞凋亡、引起自噬、阻断Ca2+通道、调节细胞内活性氧分子等^[18-19] 。肿瘤细胞的一般特点为：永生性、迁移性并且丧失接触抑制，其细胞周期的代谢异常旺盛，肿瘤组织的DNA和RNA聚合酶活性均高于正常组织^[20] 。RecQ 解旋酶在DNA 的复制、转录、修复、重组以及端粒的维持等细胞代谢过程中都发挥着非常重要的作用^[21]  ，所以RecQ解旋酶可以作为新型抗癌药物的作用靶标从而达到治疗癌症的作用^[22] 。

在本研究中，HL-22可以剂量依赖方式来抑制 MDA-MB-435细胞增殖，作用24小时IC₅₀为5μmol/L，作用48小时IC₅₀为2.7μmol/L，作用72小时IC₅₀为4.3μmol/L，用细胞集落法计数药物作用于细胞后集落数的形成和成活细胞数目的变化，结果显示HL-22具有明显抑制MDA-MB-435细胞增殖的作用。为了进一步了解其可能的抑制机制，我们进行了RT-PCR实验，结果表明，HL-22作用于MDA-MB-435细胞后，BLM mRNA表达水平明显高于正常脐静脉内皮细胞；易雪等发现在六株肿瘤细胞株中均高表达BLM mRNA，还发现了在MMC作用于Jurkat细胞48 h后BLM mRNA的水平要明显高于MMC作用24 h的水平^[23] ；根据以上结果和研究让我们推测是不是因为BLM 蛋白在维持体细胞基因组稳定性方面发挥着重要作用^[24] 这才使得HL-22对MDA-MB-435细胞增殖具有明显抑制效果。

综上所述，本研究表明汉防己甲素衍生物HL-22能有效抑制MDA-MB-435细胞增殖，这机制可能是因为汉防己甲素衍生物HL-22对肿瘤细胞的BLM mRNA表达水平造成的影响，但其具体机制有待进一步深入研究。

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