沉默GOLPH3基因表达逆转人结肠癌细胞顺铂耐药的研究

王春晓、邱成志、洪钟时、唐龙峰、庄海滨

[摘要] 目的：探讨沉默高尔基磷蛋白3（GOLPH3）基因逆转人结肠癌HT29细胞对顺铂的化疗耐药效应和机制。方法：HT29细胞分为五组：①对照组：人结肠癌HT29细胞；②转染组：siRNA沉默GOLPH3基因的HT29细胞；③实验组1：经Cisplatin处理的HT29细胞；④实验组2：经Cisplatin处理的siRNA-GOLPH3转染细胞；⑤实验组3：经Cisplatin和ERK1/2抑制剂PD98059处理的HT29细胞。人结肠癌细胞转染siRNA-GOLPH3，RT-PCR方法检测GOLPH3基因的沉默效果。MTT、克隆形成实验检测各组结肠癌HT29细胞增殖能力。Western blot检测GOLPH3蛋白，P-gp, ERK1/2和pERK1/2蛋白的表达。结果：1.相比于对照组，转染组细胞GOLPH3 mRNA和蛋白的相对表达量均明显降低（P<0.01,P<0.01），GOLPH3基因沉默效果好。2.经顺铂处理后，MTT实验显示实验组1、实验组2的增殖能力均显著低于对照组（P<0.05，P＜0.001），同时，实验组2的增殖能力明显低于实验组1（P<0.001）；克隆形成实验亦显示实验组1和实验组2的细胞集落数均明显低于对照组（P<0.01，P<0.001），同时，实验组2的细胞集落数明显低于实验组1（P<0.001）。3.实验组1的P-gp、GOLPH3、pERK1/2蛋白表达量明显高于实验组2（P<0.01）。4.实验组3的P-gp蛋白表达量较实验组1明显降低（P<0.01）。结论：沉默GOLPH3可通过抑制MAPK/ERK细胞信号通路逆转HT29结肠癌细胞对顺铂化疗的耐药性。

[关键词] 高尔基磷蛋白3；结肠癌细胞；MAPK/ERK信号通路；化疗耐药；顺铂

基金项目：福建省医学创新项目（编号2017-CXB7）；福建医科大学校教授基金（编号JS14028）

[Abstract]  Objective: To investigated the effect and mechanism of silencing of GOLPH3 gene on reversing cisplatin resistance in human colon cell HT29. Methods: Colon cancer cells were divided into five groups: ① control group: HT29 human colon cancer cell; ② transfection group: GOLPH3 gene silencing of HT29 cells by siRNA; ③ experimental group 1: HT29 cells treated by Cisplatin; ④the experimental group 2: HT29 siRNA-GOLPH3 transfected cells treated by Cisplatin; ⑤ experimental group 3: HT29 cells treated with Cisplatin and ERK1/2 inhibitor PD98059. The silencing effect of GOLPH3 gene was detected by RT－PCR and Western blot． The tumor proliferation and formation ability of HT29 cell were measured respectively by MTT and plate colony formation assay . The expressions of GOLPH3, P-gp ,ERK1/2 and pERK1/2 in HT29 cell were detected by Western blot. Results: 1.Compared with the control group, the relative expression of GOLPH3 mRNA and protein in transfection group was significantly decreased (P <0.01，P <0.01). It proved that the silencing effect of GOLPH3 gene was good. 2.The OD490 value and the tumorigenesis in experimental group 1 and experimental group 2 were significantly lower than that in the control group (P＜0．05), while the OD490 value and The tumorigenesis of experimental group 2 significantly decreased than that experimental group 1(P＜0．01). 3. Compared to the experimental group 1, the expressions of GOLPH3, P-gp and pERK1/2 in experimental group 2 were significantly decreased(P<0.01). 4. The expression of P-gp in experimental group 3 was significantly lower than that in experimental group 1 (P<0.01). Conclusion: Silencing of GOLPH3 gene could reverse the resistance of human colon cancer HT29 cells to cisplatin by deactivating MAPK/ERK signaling pathway.

[Key words]  GOLPH3; Colon cancer cells; MAPK/ERK signaling pathway; Chemoresistance; cisplatin

Fund program：Medical Innovation project of Fujian Province (2017-CXB7)；Professor Foundation of Fujian Medical University(JS 14028）

结直肠癌( colorectal cancer)为我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，我国每年新发病例大约37.5万，每年死亡病例为19.1万^[1][2]。由于结直肠癌发病隐匿的特点再加上健康体检的不到位， 60％～70％的患者在确诊时已经处于中晚期^[3]，因此，辅助化学治疗仍是结直肠癌重要治疗措施。以铂类和氟尿嘧啶为基础的FOLFOX方案是目前结直肠癌的一线用药。但化疗过程中易产生化疗药物耐药,因此，研究结直肠癌的化疗耐药相关机制并逆转肿瘤细胞耐药至关重要。

近来研究表明，GOLPH3基因可促进癌细胞的生长、增殖并抑制凋亡，是一种新的原癌基因^[4-5]，本实验采用siRNA干扰技术探讨沉默GOLPH3基因通过抑制MAPK/ERK细胞信号通路逆转HT29结肠癌细胞对顺铂的耐药。

材料与方法

1.1 材料

人结肠癌细胞株HT29（购自中科院上海细胞所）；Trizol、SuperScript III Reverse Transcriptase试剂盒（美国Invitrogen公司）；逆转录酶（立陶宛Fermentus公司）；SYBR Ex Taq试剂盒（Takara公司）；siRNA靶向GOLPH3（GCUUGCUUAAUCATGGTTAT）（吉玛公司）；Opti-MEM（上海拓然公司）；MTT（美国 Sigma 公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（上海伟进公司）；兔抗人GOLPH3多克隆抗体（Abcam,ab98023）；兔抗人P-gp单克隆抗体（Abcam ，ab170904)）；ERK1/2（Abcam,ab17942）、pERK1/2 （Abcam, ab201015）、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（南京碧云天公司Beyotime Nanking，A0208）；PCR 引物根据基因全序列设计引物（上海生工生物工程有限公司合成）；ERK1/2抑制剂PD98059(Cell Signaling Technology,9900S)Cisplatin(山东齐鲁制药厂)；GOLPH3（英国Abcam公司）

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 

将HT29人结肠癌细胞培养在RPMI Medium 1640+10% FBS培养基中，置于37 ℃、5％CO2＋95％空气的饱和湿度环境的细胞培养箱进行培养。

1.2.2 细胞分组

将结肠癌细胞分为：对照组：HT29细胞；转染组：用siRNA-GOLPH3转染的HT29细胞组(采用脂质体法，参照说明书用50 nM siRNA转染HT29细胞)；实验组1：顺铂处理后的HT29细胞组；实验组2：顺铂处理后的siRNA-GOLPH3转染细胞组；实验组3：顺铂和ERK1/2抑制剂PD98059（浓度为：50μM）处理后的HT29细胞组。各实验组细胞均在含10μM 顺铂的培养基中分别培养24h。

1.2.3 RT-PCR检测结肠癌细胞株HT29转染前后GOLPH3 mRNA的表达  

用RT-PCR检测对照组及转染组的GOLPH3 mRNA的表达。用Trizol裂解法提取结肠癌细胞株总RNA,溶于适量RNase free的超纯水中,用分光光度计检测RNA浓度。将RNA逆转录为cDNA,以GAPDH作为内参,进行RT-PCR反应。GOLPH3 上游引物F: 5’-AGGGCGACTCCAAGGAAA-3’下游引物R: 5’-TGATGTGTAACCCTCGCG-3’产物长度：83 bp；18S rRNA:上游引物F: 5’-GGTCATAAGCTTGCGTTGATTAAG-3’下游引物R: 5’-CTACGGAAACCTTGTTACGACTTT-3’产物长度：189 bp。反应条件：95 ℃预变性20 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共循环45次，在退火阶段检测荧光；融解曲线条件为50 ℃ 15 s，51 ℃升温至99 ℃，每升高一度停留5 s；数据分析通过相对定量－ΔCt法进行。

1.2.4 MTT法检测各组细胞增殖

各组细胞经胰酶消化后，接种于96孔板，每孔加100μl（1×10^5个细胞），贴壁培养24h后每组设4个复孔及对照孔，对照孔仅加入细胞不做处理。 培养48h后，每孔加5mg/ml的MTT 10μl培养4h，弃培养液。 每孔加DMSO 150μl，避光振荡混匀，结晶溶解后用酶标仪检测波长490nm的吸光度A值，以上步骤重复3次，取平均值。

1.2.5克隆形成实验检测各组细胞增殖能力

1.血球计数板计数细胞，6孔板每个孔各接种不同处理类型的细胞1000个；

2.每3天换液一次，根据细胞种类不同，持续2周；

3.经常观察，待克隆长到肉眼可见，终止培养；PBS清洗一次；

4.甲醇固定20 min，PBS洗2遍；

5.0.5%结晶紫染液染色20 min；

6.PBS洗3遍，拍照计数；

7.以上步骤重复3次，取平均值。

1.2.6  Western　Blot检测各组细胞株GOLPH3、P-gp、ERK1/2、pERK1/2等蛋白质的表达   

将处于对数生长期的各组细胞，用PBS缓冲液清洗一次，再将细胞溶解在RIPA裂解缓冲液，在冰上作用20分钟。用BCA法测定蛋白浓度，分别利用细胞裂解液提取的细胞的总蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳后湿转至NC膜，含5%脱脂奶粉的PBST室温封闭60min，分别加入一抗GOLPH3、P-gp、ERK1/2、pERK1/2，4 ℃孵育过夜；PBST漂洗20 minx3次；加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗溶液，室温孵育1 h；PBST漂洗10 minx3次；ECL化学发光试剂检测。图像应用Image-J软件进行灰度分析，目的蛋白表达的相对强度=目的条带的灰度值/GADPH条带的灰度值。

1.3  统计学方法

数据分析采用SPSS19.0统计软件，计量资料以平均数±标准差（`c±s）表示，各实验组与对照组间比较采用Dunnett-t检验，各实验组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），实验组两两比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1. HT29结肠癌细胞转染效果检测

1.1 HT29细胞转染后GOLPH3 mRNA 和蛋白的检测

如图1，图2所示，与对照组（HT29细胞）相比，转染siRNA-GOLPH3的HT29细胞中的GOLPH3 mRNA 和蛋白的相对表达量明显降低（P<0.01），说明转染siRNA成功沉默人结肠癌细胞HT29中GOLPH3的表达。

图 1 GOLPH3 mRNA在对照组与转染组中的表达比较

注：与对照组比较， **P<0.01

图 2 GOLPH3 蛋白在对照组与转染组中的表达比较

注：与对照组比较， ***P<0.001

1.2转染组HT29细胞增殖及成瘤能力检测

MTT法检测HT29细胞增殖：转染组的OD₄₉₀值（0.715±0.074）明显低于对照组OD₄₉₀值（1.007±0.130）（P<0.01）；表明沉默GOLPH3基因表达后结肠癌细胞增殖能力显著降低（图3）。平板克隆形成实验的结果：对照组与转染组的集落数分别为：（463.300±43.020）、（341.700±54.930），转染组细胞集落数明显低于对照组的集落数，差异有统计学意义（P<0.05）；表明沉默GOLPH3基因表达后其癌细胞成瘤能力显著降低（如图4）。

图 3转染组与对照组癌细胞的增殖比较

注：与对照组比较， **P<0.01

图4：转染组与对照组癌细胞集落数比较 注：与对照组比较，*P<0.05

2.沉默GOLPH3基因表达对HT29细胞顺铂化疗的影响

2.1  MTT法检测各组细胞增殖：

如图5所示，对照组、实验组1和实验组2的OD₄₉₀值依次明显降低，两两比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.001）。表明沉默GOLPH3基因表达后可提高HT29结肠癌细胞对顺铂的敏感性（图3）。

图3：Cispatin抑制实验组1、实验组2结肠癌细胞增殖的比较 注：与对照组比较:* P<0.05, *** P<0.001；与实验组1比较：### P<0.001

2.2克隆形成实验检测各组细胞成瘤能力

对照组、实验组1和实验组2细胞的集落数分别为：（604.700±39.700）、（442.3±34.27）和（126.300±45.650），实验组1和实验组2的细胞集落数均明显低于对照组的细胞集落数，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.001）。同时，在顺铂处理的条件下，实验组2的细胞集落数明显低于实验组1的细胞集落数，差异有统计学意义（P<0.001）。表明沉默GOLPH3基因表达可提高顺铂对HT29结肠癌细胞成瘤能力的作用（见图4）。

图4：Cispatin抑制实验组1、实验组2结肠癌成瘤能力的比较

A:各组细胞在平板培养皿的克隆形成图。B: 各组细胞克隆形成情况比较。

注：与对照组比较:** P<0.01, *** P<0.001；与实验组1比较：### P<0.001

3. 沉默GOLPH3基因表达逆转HT29细胞对顺铂化疗耐药的机制

3.1 HT29细胞GOLPH3基因过表达影响pERK1/2蛋白表达

如图5、表1所示，顺铂处理并沉默GOLPH3表达的HT29细胞（实验组2）的GOLPH3、P-gp的蛋白表达水平较实验组1同步明显降低，差异有统计学意义（P<0.01），提示在顺铂处理的条件下，沉默GOLPH3基因表达能在一定程度上逆转HT29结肠癌细胞对顺铂的耐药性。同时，ERK1/2蛋白在实验组1，2及对照组均无显著差异,而实验组2的pERK1/2蛋白显著低于实验组1，差异有统计学意义（P<0.01）。在顺铂处理条件下，沉默GOLPH3基因表达能明显降低ERK1/2磷酸化活性成分pERK1/2的生成从而下调MAPK/ERK细胞信号通路活性。因此GOLPH3过表达参与HT29细胞对顺铂的化疗耐药与激活MAPK/ERK细胞信号通路相关。

图5顺铂处理对实验组1、实验组2细胞相关蛋白表达的影响。A：各组细胞蛋白条带图 B:各组细胞蛋白相对表达量比较。 注：与对照组比较 NS P>0.05, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001；与实验组1比较：## P<0.01, ### P<0.001

表1:实验组1、实验组2中相关蛋白相对表达量

注：与对照组比较 NS P>0.05, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001；与实验组1比较：### P<0.001 

3.2 GOLPH3基因过表达对HT29细胞MAPK/ERK信号通路的影响

如图6、表2，在上述实验基础上，进一步实验结果显示，顺铂处理并采用MAPK/ERK信号通路阻滞剂（PD98059），实验组3中P-gp的蛋白相对表达量比实验组1显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。表明在顺铂处理条件下，阻断MAPK/ERK信号通路后可在一定程度上逆转HT29结肠癌细胞对顺铂的耐药性。

图6 Western Blot实验检测实验组1、实验组3中癌细胞相关蛋白表达情况。A：各组细胞蛋白条带图 B:各组细胞蛋白相对表达量比较。 注：与对照组比较 NS P>0.05, ** P<0.01, *** P<0.001；与实验组1比较：## P<0.01.

表2:实验组1、实验组3中相关蛋白相对表达量

注：与对照组比较 NS P>0.05, ** P<0.01, *** P<0.001；与实验组1比较：## P<0.01.

讨论

顺铂是第1代铂类化疗药物，1971年首次用于癌症患者的临床治疗^[6]，当顺铂进入细胞内引起DNA交联损伤，DNA双链之间会发生共价连接，导致双链不能分离，从而无法完成转录或复制等细胞增殖的必须过程^[7]，并可形成DNA蛋白质交联及链间交联，从而在核酸水平上阻断细胞DNA的复制及转录，抑制肿瘤细胞分裂进而诱导其凋亡^[8-9]。目前对顺铂的耐药机制研究主要包括以下几方面^[10]：1、肿瘤细胞中顺铂积累量减少；2、顺铂失活增多；3、DNA损伤修复功能提高；4、肿瘤细胞凋亡抑制。在上述主要化疗耐药机制中，研究信号通路的异常激活和基因表达异常及其机制成为当今预测化疗耐药和选择化疗药物的热点。

GOLPH3基因，也称为GPP34，定位于5p13上，编码高尔基体复合物的一种约34KDa的相关蛋白质。我们前期研究表明：人结直肠癌组织中GOLPH3蛋白存在过表达，与细胞分化差、淋巴结转移、分期晚、增殖正相关，与凋亡呈负相关，与结直肠癌组织血管生成有关，可激活Wnt细胞信号通路^[11-15]。

本研究中我们用siRNA干扰技术转染siRNA-GOLPH3，下调GOLPH3基因的表达水平，结果显示：在顺铂处理下，转染组HT29细胞的增殖能力降低，同时GOLPH3、P-gp、 pERK1/2蛋白表达量亦同步下降，阻滞MAPK/ERK信号通路活性，可显著降低实验组中P-gp蛋白相对表达量，这表明沉默GOLPH3基因表达能在一定程度上逆转结肠癌HT29细胞对顺铂的耐药性，其机制与MAPK/ERK信号通路异常激活有关。

促分裂原激活的蛋白激酶( mitogen activated proteinkinase，MAPK) 是细胞生长和分化的重要环节，越来越多的研究关注到MAPK信号转导系统在肿瘤对铂类化疗药物的耐药作用^[16]。ERK1/2信号通路则是MAPK信号转导系统中的经典通路，ERK1/2 信号通路过度激活与许多肿瘤对铂类耐药性产生存在明显的相关性，其作用机制可能是通过调控耐药相关基因和蛋白的表达^[17]。P-gp是由多药耐药基因编码的一种跨膜糖蛋白，是细胞产生多药耐药的分子基础^[18]。Bo Chen等^[19]在胃癌与化疗药物耐药的研究中表明MGC803胃癌细胞可通过ERK1/2信号通路作用于MDR1继而促进P-gp的表达而产生耐药性，相似的，Kazuhiro Katayama^[20]在MCF-7乳腺癌细胞对紫杉醇化疗耐药的研究中也得出相似的结论。国内学者关于卵巢癌中ERK1/2酶活性与P-gp的表达的研究中发现卵巢癌中ERK1/2通路的激活亦通过调控MDR1/P-gp的表达参与其耐药性的产生^[21]。

综上所述，沉默GOLPH3基因的表达可一定程度上逆转HT29结肠癌细胞对顺铂的化疗耐药，其机制是通过抑制MAPK/ERK细胞信号通路。GOLPH3可作为结肠癌逆转化疗耐药的潜在新靶点。

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