有机磷农药中毒致SD大鼠急性肺损伤的严重程度与NF-κB表达的相关性研究

崔艳^[1]  曹小平^[2] 

川北医学院附属医院急诊医学科， 四川 南充637000

【摘要】　目的　通过测定氧化乐果中毒Sprague Dawley（SD）大鼠血清NF-κB的浓度、肺组织NF-κB表达水平以及肺系数，探讨NF-κB与肺损伤严重程度的相关性。方法　将96只雄性健康SD大鼠（6周龄）随机分为对照组（A组）和染毒组（B组），每组48只，B组用0.4%氧化乐果乳油工作液以大鼠经口半数致死量45 mg/kg灌胃染毒建立有机磷中毒模型，A组以等量无菌生理盐水灌胃。分别于灌胃后30 min及3、6、12、24、48 h从各组中抽取6只大鼠并处死，测定各组肺系数、血清NF-κB浓度、肺组织NF-κB表达水平。结果 （1）血清NF-κB浓度与肺系数呈正相关（r=0.80）；（2）肺组织NF-κB表达水平与血清NF-κB浓度呈正相关（r=0.79）；（3）肺组织NF-κB表达水平与肺系数呈正相关（r=0.84）；（4）光镜下，B组染毒后30分钟肺组织开始出现肺间质充血，肺泡间隔增宽，局部可见肺泡内红细胞聚集，并逐渐加重，至12小时，病变达到高峰，24小时以后病变逐渐减轻。 结论 氧化乐果中毒致SD大鼠肺损伤的严重程度与NF-κB表达水平呈正相关，NF-κB可能参与了有机磷农药中毒时肺损伤的过程。

【关键词】　有机磷农药；急性肺损伤；核转录因子-κB

 Experiment On The Correlation Of Nuclear Factor-κB Of Sprague Dawley Rats’Acute Lung Injury Induced By Organophosphorus Pesticide　

Corresponding author: Xiao-ping,CAO  E-mail: cxp120@126.com

First author: Yan,Cui The emergency department of affiliated  hospital of North Sichuan Medical College

【Abstract】 Objective  To explore the relationship between NF-κB and pneumonedema and the mechaniam of lung injury in AOPP by observing the change of the blood serum NF-κB consistence, NF-κB level of lung tissue and lung coefficient. Method 96 healthy SD rats were randomly divided into two groups: group A(control,48 rats),group B(poison,48 rats). Group B were gavaged with omethoate (45 mg/kg), group A were gavaged with normal saline. Take out 6 rats from each group at designated observing point, then kill the rats , measure the lung coefficient, blood serum NF-κB concentration and NF-κB level of lung tissue. Results (1) The correlation between blood serum NF-κB and lung coefficient is positive, the correlation coefficient R is 0.80; (2) The correlation between NF-κB level of lung tissue and blood serum NF-κB consistence is positive, R is 0.79;(3) The correlation between NF-κB level of lung tissue and lung coefficient is positive, R is 0.84;(4)In the light microscope, B group, 30 minutes after the poisoning, pulmonary tissue occurred pulmonary interstitial congestion, the alveolar septum widened, and the local red blood cell aggregation in the alveolar was observed. By 12 hours, the lesion reached a peak, and the lesion was gradually alleviated within 24 to 48 hours, but it did not completely return to normal. Conclusion there were showing positive correlation between blood serum NF-κB and lung coefficient, NF-κB level of lung tissue and blood serum NF-κB consistence, NF-κB level of lung tissue and lung coefficient of lung injury of rats reduced by omethoate poisoning. The NF-κB may do have a hand in process of lung injury induced by organophosphorus pesticide.

【Key words】Omethoate poisoning; Acute lung injury; Nuclear factor-kappa B

   急性有机磷农药中毒（acute organophosphorus pesticide poisoning，AOPP）是目前临床上最常见的农药中毒，也是急诊科常见的急危重症之一。 中国作为一个农业大国，每年有机磷中毒人数超过5万人，病死率达10%^[1]。重症AOPP患者多合并多器官功能障碍，肺往往是最早受累器官。有文献报道AOPP患者急性肺水肿发生率为20～30%^[2]，呼吸衰竭为AOPP患者最重要的死亡原因。多学者认为, ALI/ARDS 是多种炎症介质反应及相互作用的结果，促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间的动态平衡是影响 ALI/ARDS 预后的重要因素，并且作用于肺组织炎症反应、组织再生修复的平衡全过程。一旦上述细胞因子之间的动态平衡被打破，则发生炎症介质失控性释放，导致肺组织及全身靶器官组织损伤，进而发生 ALI/ARDS^[3]。 Ansaldi D^[4]等认为，NF-κB的活化是炎症反应的中心环节，并参与了肺部疾病的病理过程。本研究通过测定氧化乐果中毒Sprague Dawley（SD）大鼠肺系数、血清NF-κB的浓度、肺组织NF-κB表达水平，旨在探讨有机磷农药中毒致大鼠肺损伤的严重程度与NF-κB的相关性，为AOPP的治疗提供新的靶点。

1. 材料与方法

1.1 建立动物模型

选择健康雄性SD大鼠（6周龄）96只，体质量200～250g，随机分为两组，A组为对照组（n=48只），B组为染毒组（n=48只）。A组灌胃注射无菌生理盐水，B组以0.4%氧化乐果乳液工作液（40%氧化乐果乳液1 ml加99 ml生理盐水稀释而成）以45 mg/kg灌胃染毒建立AOPP模型。B组以出现流涎、肌颤、呼吸困难、步态不稳为标准制作AOPP研究模型，剔除中毒不明显以及死亡个体。将实验过程分为染毒后或灌注生理盐水后30 min及3、6、12、24、48 h 六个观察点。

1.2 标本留取

   在对应时间点分别于各组随机抽取6只大鼠，用1%的戊巴比妥钠麻醉大鼠后，分离腹主动脉，抽取全血，4 ℃静置3 h自然凝固，然后高速冷冻离心机3000rmp离心5 min，小心提取上层血清放置-80 ℃冰箱内备用；用颈椎脱臼法处死大鼠，打开胸腔，取出肺组织，用生理盐水冲去表面血迹后用滤纸擦干并称质量，将双肺分别用4%多聚甲醛固定后脱水、包埋、切片。

1.3 数据检测

    肺系数采用肺系数=肺湿质量（g）/体质量（g）×100% 公式计算。用免疫组织化学法测肺组织NF-κB水平，于200倍光学显微镜下拍照，图片中棕黄色代表NF-κB，主要位于细胞核内，细胞质中也可有少量表达，肺组织中NF-κB越高，棕黄色部分着色越深。用IPP 6.0软件分析图片吸光度，用吸光度值代表肺组织的NF-κB水平。所有标本采集完毕后，将血清标本冻融，用酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定血清NF-κB浓度。

1.4 统计学方法

所有计量资料均采用SPSS20.0统计软件分析。定量资料以（`x±s）表示，采用t检

验进行统计学分析。用Logist回归分析血清NF-κB浓度与肺组织NF-κB水平以及血清NF-κB浓度、肺组织NF-κB表达水平与肺系数的相关性。

2. 结果

2.1 血清及肺组织NF-κB表达水平以及肺系数的变化

B组大鼠血清及肺组织NF-κB表达水平均高于A组 (P<0.05)，肺系数高于A组（P<0.05），见表1。

2.2肺组织NF-κB表达情况

将肺组织进行免疫组化染色后。A组大鼠各时间点肺组织切片正常（图1：A1~A6）；B组大鼠肺组织于染毒后30min出现肺间质充血，见少量炎性细胞浸润（图1：B1），染毒3~6h肺泡壁有轻度增厚，肺泡间隔增宽，肺泡内有水肿并伴有红细胞聚集，可见较多炎性细胞，并逐渐加重（图1：B2~B3），至染毒12h 时达到高峰（图1：B4），24~48上述变化逐渐减轻（图1：B5~B6）。

注：A1~A6:A组灌胃30min、3h、6h、12h、24h、48h；B1-B6:B组灌胃染毒30min、3h、6h、12h、24h、48h

图1 肺组织免疫组化检测NF-κB表达（× 200）

2.3 NF-κB表达与肺系数相关性

  血清NF-κB浓度与肺组织NF-κB表达水平呈正相关，血清NF-κB、肺组织NF-κB表达水平与肺系数呈正相关（图1～3）

                  图1 血清NF-κB浓度与肺系数相关性（r=0.80 p=0.036 ）

          图2 肺组织NF-κB表达水平与肺系数相关性（r=0.84 p=0.030 ）

图3 血清NF-κB浓度与肺组织NF-κB表达水平相关性（r=0.79 p=0.041 ）

3. 讨论

    有机磷杀虫剂是目前农业生产中使用最广泛的杀虫剂，其导致的急慢性中毒是临床急诊的常见的病例，而AOPP占急性中毒的49.1%，占中毒死亡人数的83.6%^[5]。有机磷中毒的主要机制是有机磷抑制胆碱酯酶活性，导致大量乙酰胆碱堆积，使神经系统和胆碱能神经过度兴奋，而后抑制或衰竭，从而引发一系列症状和体征。同时，重症AOPP患者多合并多器官功能障碍，急性肺水肿呼吸衰竭是AOPP患者最重要的死亡原因。近年来，研究发现非胆碱能机制在脏器损伤过程中的作用更明显。

NF-κB 是一种存在于多种组织细胞中的核转录因子，在皮肤、肺、淋巴结、骨骼、胚胎组织中均有广泛表达^[7]。在正常情况下，NF-κB绝大多数以无活性的形式存在于细胞浆中，当细胞受到各种刺激后，NF-κB与其抑制蛋白IκB分离后而被激活，从而参与各种疾病的病理生理过程^[8,9]。Ansaldi D^[4]等通过转染荧光素酶到大鼠肺组织的NF-κB受体上发现，转染了荧光素酶的大鼠肺组织中NF-κB的表达随肺组织中脂多糖的变化而变化。有报道显示急性百草枯中毒患者外周血NF-κB活性高于健康对照组^[10]。实验研究表明，染毒组大鼠血清NF-κB浓度、肺组织NF-κB表达水平、肺系数均高于对照组（P<0.05），大鼠血清NF-κB浓度、肺组织NF-κB表达水平与肺系数呈正相关，表明NF-κB在AOPP致肺损伤过程中起着重要作用。

AOPP时，机体同时存在促炎与抗炎反应，炎症介质与抗炎介质的过度释放及二者之间的失衡是AOPP引起多器官功能障碍的重要机制之一^[11]。有研究显示^[12,13]，在机体受到病原体感染时，机体炎症效应细胞表面受体识别病原体表面的抗原，再通过一系列抗原、抗体反应及酶的活化途径，进而激活细胞内转录因子（如NF-κB），最终诱导炎性介质及多种促炎因子的生成和释放。实验研究表明，染毒组肺组织NF-κB 蛋白平均光密度（MOD）值明显上升、NF-κB 蛋白表达量明显增加（P <0.01），光镜下可见染毒组染毒后30分钟肺组织开始出现肺间质充血，肺泡间隔增宽，局部可见肺泡内红细胞聚集，并逐渐加重，至12小时，病变达到高峰，24至48小时病变逐渐减轻。Ansaldi D^[4]等报道，在出现肺水肿前，提前给予糖原合成酶激酶-3β抑制剂TDZD-8治疗，可以降低肺组织中NF-κB的活化，从而抑制炎症趋化因子MIP-1B的释放，并且诱发抗炎因子IL-10的释放。习亮等^[14]发现SP能够促进脊髓星形胶质细胞活化并分泌NO、TNF-α、IL-1β，而NF-κB 信号通路抑制剂SN50能够降低SP的上述作用。陆翠华^[15]等实验证实，NF-κB拮抗剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）治疗组肝组织NF-κB和TNF-α mRNA蛋白的表达均较肝纤维化模型组和生理盐水组明显下降，说明 PDTC 能有效抑制氧化应激所致的NF-κB 活化，减少TNF-α 等炎症介质分泌，表明 PDTC可通过抑制 NF-κB 表达，减少细胞外基质的沉积，缓解肝纤维化进程。因此，减低AOPP大鼠肺组织NF-κB蛋白的表达量，可抑制下游炎症因子的释放，减轻肺组织损伤，具有肺保护的作用。

综上所述，氧化乐果中毒致SD大鼠肺损伤的严重程度与NF-κB表达水平呈正相关，NF-κB参与了AOPP致肺损伤的过程。AOPP时，应及早进行抗炎治疗，恢复促炎/抗炎反应的动态平衡，抑制NF-κB的活化，对临床治疗AOPP具有重要意义。

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