新科幻稿件信息
男性肿瘤患者生育力保存的研究现状
赵宝运，田稼2，马良宏2
（1.宁夏医科大学，宁夏 750004；2.宁夏医科大学总医院，宁夏人类精子库,宁夏 750004）
摘要：
目前全球范围内肿瘤的发病率逐年升高，男性患者多于女性患者并呈年轻化趋势。年轻癌症患者经治疗75%以上的可长期生存[1]。但由于肿瘤本身和肿瘤治疗过程对生育力的影响可导致男性生育力下降，甚至造成生殖功能的永久丧失。因此，在治疗前保护和保存生育力对于提高患者生活质量具有重要意义。本文主要针对目前男性肿瘤患者生育力保存技术、研究现状作一综述。
关键词：男性；肿瘤患者；生育力保存；现状
Research Status of Fertility Preservation in Male Cancer Patients
ZHAO Bao-yun1,TIAN jia2,MA Liang-hong2
1.Ningxia Medical University,Ningxia 750004,China;
2.General Hospital of Ningxia Medical University,Human Sperm Bank of Ningxia,Ningxia 750004,China
【Abstract】At present, the incidence of cancer in the world is increasing year by year. Male patients are more than female patients and the incidence rate of cancer in young people is increasing.More than 75 percent of young cancer patients can get long-term survival after treatment[1].However,because the tumor itself and tumor treatment process on the impact of fertility will cause male fertility to decline and even lead to permanent loss of reproductive function. Therefore, the protection and preservation of fertility before treatment is of great significance to improve the quality of life of patients. This paper mainly reviews the technology and research status of fertility preservation in male cancer patients.
【Key words】male; tumor patients;fertility preservation; research status
一、肿瘤发病现状
肿瘤是目前危害人类健康的常见危险因素，中国癌症的发病率和死亡率位居世界前列，且发病率和死亡率不断上升[2]。国家癌症中心2016年最新调查数据显示，全国恶性肿瘤发病率为 270.59 /10 万 ，男性 293.79/10 万，女性 246.21/10 万[3]。国外调查数据显示男性肿瘤患者整体发病率明显高于女性患者，肿瘤患者年轻化趋势越来越明显，45岁以下肿瘤患者占总患者10%左右，20岁以下占到1.1%[4]。
随着肿瘤治疗方法的多样化，如手术、化疗、放疗、免疫治疗、多学科综合治疗等，肿瘤治疗的有效性不断提高，患者生存率逐年升高。美国一项针对38万儿童肿瘤患者的研究表明目前儿童肿瘤患者5年生存率为83.5%，20年生存率为44.9%，儿童肿瘤患者有5%可存活到60岁，其中部分肿瘤的60岁存活率可达到15%左右，如生殖细胞、滋养层肿瘤、性腺肿瘤和软组织肿瘤[5]。目前肿瘤患者治疗的重点从追求治愈，延长生存时间，到现在提高患者生存质量及生命繁衍发生转变。研究报道青少年肿瘤患者，治疗前行精液冷冻，临床受孕率在23%-57%之间[6]。
二、肿瘤对男性生育力的影响
1．肿瘤对男性生育力的影响
某些肿瘤本身会影响精子的发生，Chung等报道发现未经治疗的患者中，28%的睾丸癌、25%的霍奇金淋巴瘤、57%的白血病及33%的胃肠道肿瘤患者均存在少精症[7]。恶性肿瘤引起精液质量异常的机制至今仍不明确，可能与肿瘤本身通过影响机体内分泌、营养状态、新陈代谢干扰精子的形成相关，营养因素如矿物质、维生素及微量元素的缺乏[8]。睾丸肿瘤新生血管的形成，可引起睾丸局部血流改变和阴囊局部温度升高，这些结果均可影响正常的生精环境[9]。肿瘤自身免疫产生的细胞因子和抗精子抗体可损伤精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）及Leydig细胞，造成精液质量的异常[10]。然而目前有研究显示肿瘤对精液质量的影响尚存在争议，Ragni G等认为患者的精液质量与恶性肿瘤类型有关[11]，Rofein和Gilbert等比较了214名不同肿瘤患者的精液参数（精子数量、精子活力等）与22名非肿瘤患者的精液参数，结果发现各组精液质量无统计学意义，他们认为肿瘤与精液质量无明显相关性[12]。
2．肿瘤治疗过程对生育力的影响
2.1 手术治疗 生殖系统部位的外科手术已被证实可造成生殖系统损伤，引起男性不育，如临床上睾丸癌的传统手术方式为根治性睾丸切除及腹膜后淋巴结清扫术，无论单侧或双侧睾丸切除均会损伤男性生育力，淋巴结清扫可引起交感神经节损害引起不射精或逆行射精[8]。腹会阴部的肠道肿瘤手术由于损伤神经可影响男性射精障碍[13]。根治性前列腺切除术由于去除男性重要的生殖器官可造成男性不育，并可引起勃起功能障碍[14]。同时，手术方式的改进可减轻对男性生育力的损害 [8,10]。
2.2 放射治疗 研究显示男性生育功能损坏的程度跟接受放疗剂量的多少相关。如当成年男性患者接受放射剂量>0.1-1.2戈瑞（Gray，Gy）就会对精子的形成产生影响，当剂量>4Gy时便可造成不可逆的损失，而青少年患者放射剂量>6Gy时就可造成永久性的无精子症[6,15]。研究表明精原细胞和SSCs对放射线高度敏感，较少的剂量就可使其分化障碍,Leydig细胞对放射线抵抗力较强，但当成年男性照射剂量>30Gy时可造成Leydig细胞功能损害，青少年剂量则为>20Gy[16,17]。放射线不仅可影响精子的数量，还可造成精子DNA的断裂，这种情况可持续至治疗结束两年以上，且随剂量的增加，持续时间延长[18]。男性患者放疗后生精功能的恢复时间长短与接受的放射剂量同样呈正相关，当剂量小于1Gy，需要9-18个月恢复，当剂量在2-3Gy之间，需要30个月恢复。当剂量达到4Gy，则需要5年左右才能恢复到同龄正常水平[10]。
2.3 化学药物治疗 化学药物不仅可杀死肿瘤细胞，同时可跨过血睾屏障，引起精原干细胞的损伤、DNA突变，并可造成睾丸间质纤维化[19]。也可通过影响DNA的合成及叶酸代谢促使细胞分裂能力降低，最终导致患者生精功能暂时或永久性丧失[15]。患者生育力损害的程度与化疗药的种类、剂量及化疗药的组合方式相关，烷化剂最初用于霍奇金淋巴瘤的治疗，但研究显示烷化剂与高风险无精子症相关，高剂量(600mg/m2)顺铂可造成67%的Ledig细胞功能障碍[10,18]。临床上ABVD化疗方案的应用显著的降低了患者生育力的损伤，相关研究显示此方案治疗后患者1-5年内生精功能恢复90%，且不影响患者的生存[17,18]。
三、男性肿瘤患者生育力保存研究现状
临床上新发的肿瘤患者逐年增多，治疗方法不断更新，多数肿瘤患者可获得长期生存时间，数据显示儿童肿瘤患者经治疗后5年生存率达80%左右[5]。正如上述所说各种治疗方法均可造成患者生育力下降，因此治疗前行育生力保存可为患者获得子代提供保障。对于成年患者，治疗前低温冷冻精液是保存生育力的最佳方法，但冷冻-解冻过程中可能影响精子的形态、活力及细胞膜等[20]，因此技术的改进对于成功受孕至关重要。对于部分青春期或青春期前无成熟精子的患者，治疗前可选择未成熟睾丸组织(Immature testicular tissue,ITT)和SSCs冷冻保存生育力，虽然这些技术有报道应用于临床，但目前仍处于动物实验阶段[21]。应用药物保存生育力在部分动物实验中证实有效，但对于患者生育力保存的效率不高，临床价值较小[18,22]。下面我就目前男性生育力保存技术和研究进展分别加以综述。
1睾丸组织（Testicular tissue，TT）冷冻保存技术 该项技术是指治疗前通过外科手术或是组织穿刺技术获取患者部分TT，加入相应的组织保护液后冷冻保存，待患者治疗结束后，复苏TT，通过组织移植或体外培养等技术产生正常精子，最后经辅助生殖技术(Assisted reproductive technology,ART)获得后代。
1.1研究进展 20世纪90年代，TT冷冻保存是治疗无精症患者一种安全有效的方法，这种方式能保存足量的精子，可进行多次体外受精（In vitro fertilization,IVF）或卵胞浆内单精子显微注射技术（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）来降低患者的花费和重复手术的风险[23,24]。由于前期的TT冷冻研究，Nugent等认为TT低温冷冻有助于青春期前接受放化疗的肿瘤患者保存生育力[25]。TT组织冷冻技术重点是保存SSCs和支持细胞，也是青春期前肿瘤患者保存生育力的潜在方法，但目前主要处于实验阶段[21]。
组织冷冻形式可选择细胞悬液或组织碎片[10]，细胞悬液的制作过程需要用机械外力或消化酶的处理，往往会影响解冻后细胞的成活率,研究发现在不考虑冷冻剂的作用下，人类睾丸组织细胞冷冻保存后，解冻后细胞的成活率约为60%[26]。此外细胞悬液缺乏细胞之间的交流，解冻后可能影响细胞的增殖及分化，在不同动物模型研究发现睾丸细胞悬液解冻后，细胞成活率在29%-82%之间波动[27]。睾丸组织细胞悬液通过自体或异体移植至受体睾丸的曲细精管后，可发现细胞的增殖及精子的产生[10],进一步的研究发现非灵长类动物中（恒河猴）也可出现同样的结果，并通过体外受精形成胚胎[28]。TT碎片冷冻保存维持了组织完整性，保持各细胞之间的信息交流（精原干细胞、支持细胞等），目前主要通过TT自体或异体移植方式恢复受体的生育功能。ITT冷冻保存在动物实验中证实有效，并经自体移植后一些动物中能成功孕育健康的后代，人类ITT冷冻保存临床实验已有报道，但仍未应用于临床[10,15]。TT的异体移植主要移植在裸鼠的皮下，生殖细胞的增殖、分化能力差，不能产生完全正常的精子[21]。但Kaneko Hiroyuki等用冷冻保存的猪胎儿睾丸组织经解冻后移植至裸鼠皮下，虽然产生了正常形态的精子，但未能成功生育后代，可能原因是不同物种之间存在基因差异[29]。
睾丸组织保存技术主要有低温冷冻和玻璃化，两者的区别是所添加冷冻剂的浓度及冷却速率不同，其中冷冻保存剂主要有二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）、蔗糖、乙二醇等。低温冷冻速率慢，所添加的保护剂浓度低，玻璃化则相反。应用二甲基亚砜和缓慢冷冻的方式已经成功应用于组织冷冻，研究显示二甲基亚砜可更好的保持干细胞之间的结构及维持细胞的生精功能，而缓慢冷冻则能更好的维持组织结构，这两种技术在动物、人类（成熟或未成熟）睾丸组织中均可成功应用[10,21]。Radaelli Moacir R M等在大鼠模型中比较了玻璃化技术与低温冷冻技术的研究中发现，两种技术均可完整保存曲细精管的形态、结构，但玻璃化稍优于低温冷冻，并且玻璃化在解冻后能维持更好的细胞活性[30]。
1.2技术优缺点 该技术适用于各年龄段的患者，其通过外科手术获取标本，方法简单，操作快捷，所需保存的样本可为睾丸细胞悬液或组织碎片。睾丸组织移植存在将癌细胞再次引入导致肿瘤复发，尤其对于睾丸肿瘤、血液病及淋巴瘤的患者，但应用细胞分离技术或细胞分类技术可减少肿瘤复发的风险[15]。睾丸组织冷冻保存存在伦理学问题，需要发现问题及完善相关的法规[31]。目前人TT冷冻、复苏的方法、体外成熟的技术主要处理实验阶段，组织库的建立可加快这些技术的发展，并尽快应用于临床。
2 SSCs冷冻保存、移植技术 通过手术获取睾丸组织碎片，经过消化酶处理、流式细胞仪、免疫磁珠等方法纯化SSCs，体外培养后冷冻保存。待患者治疗结束后，经解冻复苏后，通过显微注射至受体生精管道后获得成熟的精子。
2.1研究进展 1994年Brinster等报道了自体SSCs移植在小鼠身体上取得成功[32]，后相继证实了此项技术也可应用于兔子、猪、山羊、牛等动物[15]。然而，异种SSCs移植目前尚未成功，仅能在受体曲细精管中发现干细胞定居、增殖，不能产生正常的精子，这可能与物种基因差异有关[33]。
SSCs移植后生育力恢复效果与多种因素密切相关，首先受体精子生成的程度与移植SSCs数量呈正相关，提高干细胞的移植数量可增加移植的有效性，但目前还未发现高效的人SSCs体外培养方法[34]；其次，受体的年龄也影响移植的有效性，主要与受体体内激素、细胞因子的水平有关[35]；第三，经治疗后的肿瘤患者，其体内的微环境是否适合干细胞的生长，也直接影响到SSCs移植后的效果[10]；第四，干细胞的冷冻-解冻过程均会影响移植的成功率，冷冻会影响干细胞的分化能力 [36]。
2.2技术优缺点 该项技术同样适用于青少年或性未发育成熟的肿瘤患者；SSCs可经体外扩增，多次移植，提高移植的成功率；研究仍处于动物实验阶段，所需的冷冻技术、显微注射技术要求高；SSCs自体移植可增加肿瘤复发的风险，但有研究显示利用细胞分离可降低发生的风险率，如免疫磁珠细胞分选法、流式细胞荧光分选技术[15]。还有学者研究认为SSCs培养系统的建立可减少肿瘤的复发，因为此细胞培养系统仅允许精原干细胞的增殖[37]。SSCs移植已在多个物种实现成功，但在人体尚未应用,SSCs移植同样存在伦理问题，将SSCs分化成精子仅是肿瘤患者保存生育力的开始，在开始临床治疗前，细胞的遗传和表观遗传稳定性应当得到证实[15,37]。
3应用药物或激素保存生育力 在肿瘤治疗的同时使用药物或激素治疗，以减少化疗对睾丸组织功能的损伤，待治疗结束后，经过一段时间睾丸的生精功能恢复，最终成功生育后代。
3.1 研究进展 放、化疗可导致男性肿瘤患者暂时性或永久性无精症。最初研究Glode等认为应用激素可保持男性患者的生育力，主要的机制是激素可抑制下丘脑-垂体-性腺轴，促使睾丸内精子形成减少，从而可增加睾丸组织对化疗的耐受性，并证实应用促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hormone, GnRH)可保护小鼠睾丸组织中精子形成免受环磷酰胺的损伤[38]。但多次重复实验证实此方法并没有保护生育力的作用[39]。在非人灵长动物的研究中，这种保存方法同样没有保护作用，主要原因是物种间差异使得睾丸组织对放、化疗的反应不同[40]。多次动物实验研究显示在放化疗前或期间应用激素可缩短治疗后肿瘤患者的生精功能的恢复时间。如在小鼠的肿瘤治疗模型中，结合应用激素，发现睾酮、甲羟孕酮或两者联合应用，发现实验组曲精小管上皮细胞分化能力均有所增加，而应用GnRH拮抗剂增加最为明显[41]。在临床实验中，有作者长期研究了在治疗前或期间应用激素的7个临床试验中心的霍奇金淋巴瘤和睾丸癌患者，仅发现1个试验中心20%的患者精子数量可恢复，说明应用激素保存患者的生育能力的有效性尚不确切，仍需进行激素与睾丸生殖细胞分子生物学相关机制的研究[42]。
3.2技术优缺点 目前该技术在动物实验有一定疗效，但临床研究较少且尚无成功报道，仍需进一步研究。
4精液冷冻保存生育力 性发育成熟的肿瘤患者，在肿瘤治疗前获取精液，经精子冷冻保存。待患者治疗结束后，准备生育时行ART。
4.1研究现状 精子冷冻早在18世纪就出现，由于冷冻技术的发展，到20世纪中期出现可行的冷冻保护剂，目前精子冷冻保存相当成熟，使许多生育功能障碍的男性成功孕育后代。对于性成熟的肿瘤患者，治疗前精液冷冻保存成为其生育后代的主要方法，临床上成功的案例已报道，治疗前行精液冷冻，提高了55%患者的生育潜能[43]。
低温冷冻是保存精液的主要方法，研究显示低温冷冻可对解冻后精液的质量造成影响。主要原因是冷冻步骤可产生渗透压力、活性氧增加，造成精子DNA受损、精子细胞膜不稳定及线粒体功能丧失等[44]。为了避免冷冻引起活性氧增加对精子质量的影响，在精液冷冻过程中加入抗氧化剂或改变冷冻方法，证实可提高解冻后的精液质量[45,46]。然而，冷冻过程中加入抗氧化剂提高精液质量的方法现在存在争议，Leonidas等研究了公羊精液冷冻过程中加入抗氧化剂，发现抗氧化剂并不能保护冷冻给精液造成的渗透压力。选择合适的冷冻方法可改善复苏后精液的质量，控制冷冻速率对精液质量的恢复具有重要的作用[47]。盛慧强等在临床研究中发现肿瘤患者精液的精子浓度、前向运动精子百分率及精子冷冻复苏率均低于供精志愿者，进一步研究发现睾丸肿瘤组与非睾丸组肿瘤患者冷冻前精液质量无明显差异，但睾丸肿瘤患者精液表现更低的冷冻复苏率[48]。这说明尽管目前ART技术已足以用极少量精子可使妇女怀孕，但从生育力保存角度来说，仍应尽可能的保存更多精子，提高冷冻复苏率可能是唯一可行的方法，进行精子冷冻复苏率低下相关机制研究至关重要。
4.2技术优缺点 适用于性成熟的肿瘤患者，方法简短，获取时间短，不耽误患者的治疗时间，技术操作规范，精液冷冻时间较长，生育力保存有效性高。缺点：精液冷冻对精子产生损害，精子抗冷冻损伤机制研究较少，微量精子冷冻目前尚处于起步阶段，技术水平差异较大。
四 男性肿瘤患者生育力保存的临床策略
男性肿瘤患者保存生育力，应根据自身的疾病特点和精液质量选择合适的保存方法。成年患者治疗前可选择精液冷冻保存生育力，对于少弱精和无精症的患者可选择睾丸穿刺取精或显微取精的方法保存精子。若不能获取成熟精子的青少年患者，可选择TT移植、SSCs移植等方法，但目前主要处于试验阶段；治疗中可获取精子保存生育力，但存在基因突变可能。优化治疗方案、激素及抗氧化治疗可不同程度降低生育力损伤的风险[49]；肿瘤治疗后的患者可通过一定时间的恢复尝试生育，受精的成功率及对后代的影响尚不明确。目前，精子冷冻是生育力保存临床批准的技术，其他尚处于研究阶段，暂不能临床应用，但可根据患者自身情况，鼓励在不违背伦理原则的情况下采用试验性研究。
五 结论
随着肿瘤患者日益增多，肿瘤的发病率呈现年轻化，肿瘤的综合治疗手段可使患者长期的生存，然而这些治疗方法均有造成不育的风险。因此，治疗前行生育力保存可为这类患者获得子代提供保障。对于临床医生或肿瘤科医生来说，在面对不同特点的肿瘤患者，在行肿瘤治疗之前，应告知其目前常用的生育力保存方法，并开展相关生殖知识的普及。同时，联合生殖科医生，为患者提供最佳的生育力保存方法，给予他们生育后代的希望。
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