一例CYBB基因新突变所致慢性肉芽肿病的临床特点并文献复习

张荣 张静静 成胜权

空军军医大学西京医院儿科，陕西 西安 710032

摘要：目的   分析1例CYBB基因新突变所致慢性肉芽肿病（Chronic granulomatous disease，CGD）临床特征及基因突变特点。 方法   回顾分析1例CGD患儿的临床资料，提取患儿外周血基因组DNA，用PCR扩增CGD基因全部外显子并进行序列分析。 结果  本例患儿因“反复发热8月余”入院，入院后给予抗生素治疗后发热有所好转，但肺部CT仍提示肺部存在多发炎症伴实变；患儿基因检测提示为CYBB基因6号外显子上存在错义突变：c.560(exon6)T>G，p:I187R，导致此位点CGD编码的氨基酸由胸腺嘧啶突变为胞嘧啶，家系基因分析显示其母亲为该突变携带者，父亲未见突变；该病例中的错义变异为c.560T＞G，目前暂无文献报道，推测为新的致病突变，该突变可能引起结构域异常丧失功能，影响NADPH氧化酶功能，使其活化作用下降，进而影响吞噬细胞杀菌能力。 结论  本例慢性肉芽肿发病是由1种新发现的基因突变所致，对于慢性肉芽肿病的临床诊断及疾病的认识、产前诊断有一定补充。

关键词：慢性肉芽肿病；临床特征；基因错义突变 

Abstract: Objective The clinical characteristics and gene mutation characteristics of a new CYBB gene mutation Chronic granulomatous disease (CGD) were analyzed. Methods The clinical data of a child with CGD were analyzed and the DNA samples of all exons of his CGD gene were submitted to direct sequencing after PCR(polymerase chain reaction amplification).  RESULTS: In this case, the children were admitted to the hospital because of “recurrent fever for more than 8 months”. The fever was improved after antibiotic treatment after admission. However, the lung CT showed that the lung inflammation was heavier. The genetic test of the child indicated that the CYBB existed missense mutation: c.560 (exon6) T>G, p:I187R,resulting in the mutation of CGD-encoded amino acid from thymidine to cytosine; its mother is the carrier of the mutation, the father has no mutation; in this case the missense variation c.560T>G has not been reported in the literature. Conclusion The incidence of chronic granuloma in this case is caused by a newly discovered gene mutation, which is complementary to the clinical diagnosis and understanding of chronic granulomatous disease and prenatal diagnosis.

慢性肉芽肿病（chronic granulomatous disease, CGD）是一种少见的以呼吸爆发缺陷引起的原发性免疫缺陷病，发病率为1/20万-25万^[1]，是由于基因突变引起吞噬细胞(中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜酸粒细胞)还原型辅酶 Ⅱ（NAPDH）氧化酶复合物缺陷，导致吞噬细胞呼吸爆发功能障碍，从而失去杀伤过氧化物酶阳性细菌与真菌的能力，分为常染色体隐性遗传CGD和X-连锁慢性肉芽肿病（X-CGD），其中X-CGD最为常见。目前由于该病临床差异性大，确诊主要依据基因检测。因此本文回顾我院 1例 CGD 患儿临床表现及诊治过程，发现此例慢性肉芽肿为新突变所致，总结其临床特点，加强临床医生早期诊治本病，提高患儿生存率。

1. 临床资料及诊疗经过

1.1病例摘要

患儿，男，4岁6月，因反复发热，外院诊断“肺部感染”9月余就诊。入院前9月因发热伴咳嗽1周入住市内一家医院，诊断“支气管肺炎、EB病毒感染”，住院治疗8天后仍有发热，遂后于市儿童医院，以“大叶性肺炎合并胸腔积液”住院治疗11天，出院后患儿每天仍有反复发热，家长予以中药治疗，效果不佳。自发病以来，患儿精神、睡眠可，大小便正常。

患儿个人史：系足月剖宫产，有1姐姐体健。既往接种卡介苗后局部反应较重（家长诉接种部位有局部破溃表现），有“卡介苗性淋巴结炎”病史。

入院后体格检查：T 39.6℃，HR 108次/分，RR 24次/分，Wt 16公斤。精神、反应可，左上臂可见卡疤，咽部粘膜充血，扁桃体Ⅰ度肿大，表面无分泌物。双肺呼吸音粗，可闻及湿性啰音。心脏腹、四肢及神系统查体未见阳性体征。院前检查：血常规：WBC15.1*10⁹/L，N% 70.5%，CRP 120.4mg/L。胸片提示：两肺多发感染。左腋区斑点高密度影（图1）。入院后完善相关检查：ESR：59mm/hr（正常值0-20 mm/hr）；免疫球蛋白：IgA 4.65g/L；IgG 22.6g/L；IgE 285 IU/ml均升高（正常值IgA 0.85-4.5g/L；IgG 8-17g/L；IgE＜100IU/ml）淋巴细胞亚群计数：抑制/细胞毒细胞百分比40.47%(CD8+)（正常值13-39%）；辅助/诱导细胞百分比25.09%(CD4+)（正常值33-58%）。降钙素原组合：IL-6：129.7pg/ml；PCT:0.334ng/ml均升高（正常值IL-6＜7 pg/ml；PCT＜0.05ng/ml）。血培养：正常菌群生长。

初步诊断：支气管肺炎；反复呼吸道感染。入院后给予静滴头孢噻肟钠舒巴坦钠抗感染治疗1周后仍有发热。复查血WBC10.57 *109/L；N% 50.8%；CRP 58.23mg/L；ESR：81mm/hr；PPD试验（++）；T-spot、TB阴性。支原体抗体IgM：阳性。胸部CT：双肺多发炎症改变伴实变，考虑结核；左侧腋窝多发肿大淋巴结伴多发钙化灶，右侧腋窝可见数个小淋巴结（图2）。肺泡灌洗液：结核涂片、真菌涂片、呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、痰涂片、支原体DNA、结核杆菌DNA、甲流核酸抗体检测均为阴性。给予抗感染治疗后患儿仍有反复发热，并且肺部影像学较重，病史长且反复不愈，考虑可能是否存在免疫缺陷病或存在基础相关疾病如原发性纤毛运动障碍、支气管畸形等。根据文献及经验总结，患儿有卡介苗后异常反应包括局部破溃，同侧腋下淋巴结肿大并有液化，提示患儿存在免疫缺陷病，最常见的是慢性肉芽肿（CGD）,故考虑本病CGD可能性较大，为明确诊断，行呼吸暴发试验提示中性粒细胞的活化率为0.1%（正常>90%）。为进一步明确诊断，经家属同意将血标本行基因检测。通过对该患儿家系研究及基因分析，发现了CYBB基因的1个新的错义突变，并对该突变位点进行生物信息学预测，支持慢性肉芽肿病诊断。

1.2致病基因检测

经患儿家长知情同意后，抽取患儿及父母、同胞姐姐外周静脉血2ml（EDTA抗凝），提取基因组DNA。参照文献与OMIM数据库，进行高通量测序，并利用Sanger测序进行患儿及患儿父母的突变点验证。见图3

1.3结果

患儿CYBB基因存在杂合错义突变位点：c.560(exon6)T>G，导致氨基酸改变：p:I187R

(p.Ilel187Arg),母亲为c.560(exon6)T>G携带者，父亲及同胞姐姐正常。

1.4生物信息学预测

检索文献及基因组数据库，该患儿CYBB基因突变未见收录，c.560(外显子6)T＞G，使用生物信息学软件进行预测。建议判定标准为：Panter预测值＞0.5提示有害；PHD-SNP预测值＞0.5提示有害；SNAP预测值＞0.5提示有害；Meta-SNP＞0.5提示有害。利用生物信息学分析，该突变位点可能导致NADPH跨膜区蛋白结构域异常丧失,从而影响NADPH氧化酶功能，使其活化作用下降，进而影响吞噬细胞杀菌能力。

图3.患儿及父母基因外显子的直接测序结果

Figure 3. Direct sequencing results of children and parental gene exon

2.讨论

CGD是一种以呼吸爆发缺陷为主要特征少见的原发性吞噬细胞缺陷病，其中以X-CGD多见。在正常情况下吞噬细胞受到入侵病原体刺激后, 细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH) 氧化酶复合物可将电子从NADPH转移至分子氧,从而快速地产生超氧阴离子而发生“呼吸爆发”。若吞噬细胞功能杀伤能力降低，致使吞噬细胞在局部大量积聚，形成化脓病灶和肉芽肿。CGD患者容易感染金黄色葡萄球菌、沙雷菌、曲霉菌，少数也可感染分枝杆菌，研究表明X-CGD患儿结核感染发生率较健康人高170倍。因此临床表现多样，大多以反复发热，局部化脓性炎症为首发症状就诊，也可表现为反复呼吸道感染、淋巴结炎、肝脓肿、骨髓炎、皮肤脓肿或者蜂窝织炎，因此临床上常常误诊，经验性治疗往往效果不佳 ^[3-5]。

NADPH氧化酶复合物由5个phox亚基组成，其中gp91phox和p22phox 系细胞膜上的细胞色素 b558 成分，分别由CYBB、CYBA基因编码；而p47phox、p67phox和p40phox是胞质蛋白^[6,7]，分别由NCF1、NCF2、NCF4基因编码。CGD患儿由于其中一个基因突变，造成NADPH氧化酶活性缺陷。由CYBB基因突变引起的CGD为X连锁 CGD(X-CGD)，约占CGD病例的70%，而常染色体隐性遗传CGD( AR-CGD)中， NCF2 突变约占20%，CYBA、NCF1 突变各约占 5%，NCF4 突变仅1例报道^[5]。

目前已有300多种CYBB突变被CYBB base数据库收录。其中以错义突变最多见，其次为无义突变、片段缺失、插入及拼接错误突变等,且61%的突变发生在N端结构域，其可能与血红素结合及 p22phox相互作用有关，FAD 结合区及 NADPH 结合区的突变频率分别为20%、17%，环结构区少见，仅为2%。截止2012年，我国在基因水平诊断的CGD病例有24例中CYBB基因突变 22 例， NCF1 及 CYBA 突变各1例，其中3例患者CYBB基因在转录水平发生拼接错误，导致外显子缺失或内含子插入，但DNA水平却未发现异常,也不能确定家系中的携带者^［6］ 。因此，为尽快、准确明确致病基因,应首先分析CGD 相关基的cDNA,以减少漏诊。临床实验数据表明，基因表型与临床表型并无相关性^[7,8]，具有相同的基因型而临床表现却有很大差异，临床表现不一。其中反复感染及肉芽肿表现为CGD临床特征，临床报道的病例中均有肺部感染，有的合并有淋巴结炎、反复腹泻、脓疱疹及肛周脓肿等多个部位的感染。报道有7例患儿有卡介苗（BCG）接种或结核感染史， 其中例患播散性卡介苗病，仅2例找到抗酸杆菌，多数未找到抗酸杆菌，而依据肺部 CT 特征、 PPD 试验、 淋巴结活检及诊断性抗结核诊断治疗^[9,10]。 因此我们推测中国 X-CGD 患者对结核分支杆菌易感。曾报道^[11]来自同一家系的2例XCGD 患儿，具有相同的基因型，而临床表现却有很大差异，提示可能有其他因素影响 X-CGD 患儿的临床表现型，比如个体免疫系统差异、调控基因及环境因素等有关。

慢性肉芽肿为罕见病，随诊基因检测技术发展普及，除了传统方法的诊断方法外，家族谱的基因检测对诊断也起关键性依据。传统筛查CGD的方法为四唑氮蓝试验（NBT试验： CGD患者NBT检测阳性＜5%，健康人＞95%），而目前采用二羟罗丹明 123(DHR)试验(用流式细胞术分析中性粒细胞在佛波酯刺激后，细胞内产生的过氧化氢将无荧光的DHR123氧化为有荧光的罗丹明的程度) 方法更敏感、准确，并能发现轻症CGD患者和携带者^[12]。随着基因检测的普及，可从分子水平发现致病基因确诊CGD，且可检测携带者，进行产前诊断。

本例临床上表现既往有卡介苗接种后的异常反应，反复肺部感染，胸部CT提示双肺多发炎症改变伴实变，且左侧腋窝多发肿大淋巴结伴多发钙化灶，右侧腋窝可见数个小淋巴结，实验室检查Ig系列明显升高，具有典型的慢性肉芽肿表现，本病例PPD试验阳性，而T-sport及肺泡灌洗液检查阴性，考虑存在牛型结核杆菌感染而非人型结核杆菌感染，因为卡介苗是使用无毒的牛型分支杆菌制成，而监测的T-sport是人型结核杆菌特异性的淋巴细胞，故可表现为PPD阳性，T-sport阴性。而呼吸爆发实验及CYBB基因突变更明确支持慢性肉芽肿病诊断。基因检测证实此患儿存在CYBB新的 1个突变位点，即第560位氨基酸由胸腺嘧啶错义突变为胞嘧啶，母亲为c.560(exon6)T>G携带者。佳经查询检索千人数据库、MAF、dbSNP、千人北方等多个数据库，该位点不属于多态位点，在人群中发生频率极低，为有害突变，且目前国内外文献尚未报道，该位点突变是NADPH细胞膜上的结构域跨膜突变，通过生物信息学分析，此位点编码的蛋白虽然不是细胞色素b245的核心蛋白，但也可能会影响呼吸链中一系列细胞吞噬功能。

目前CGD治疗主要是长期使用抗生素和抗真菌、结核药物预防细菌和真菌感染， 唯一能根治CGD的方法就是包括干细胞移植和基因治疗。成功接受HSCT(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)治疗的CGD患者几乎能达到无病存活，生活质量接近于正常人群水平^［13,14］。但HSCT治疗本身具有局限性，包括供体的可得性、预处理放化疗的相关风险，以及宿主和供体免疫系统相互作用引发的疾病^［15］,其中最为严重的是移植因移植物抗宿主病( graft-versus-host disease，GVHD) 等情况而死亡。然而，至少有 1/3 的患者不能找到人类白细胞抗原（HLA）相合的捐赠者，随着分子生物学技术的发展，基于自体造血干细胞修复的基因治疗已经用于治疗X-CGD患者。但仍处于临床试验阶段，临床效果短暂，且有较大的致病风险，需要找到安全有效的方法来提高长期植入率及外基因的表达水平，并减少有害突变^[16,17]。该病例患儿目前生命体征平稳，外院服用抗结核药物和抗真菌药物预防感染，也在等待骨髓配型成功进行干细胞骨髓移植。

因此，我们需要提高对于本病的认识，在临床上，对于自幼反复出现严重肺部、淋巴结肝脾、骨骼和皮肤细菌、真菌感染，有肉芽肿形成，接种卡介苗后出现BCG感染或怀疑结核而抗结核治疗效果不好者，均应怀疑本病。这对于早期诊断及预后有很好的指导作用，也为产前诊断提供了重要依据。

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