CD14+单核细胞T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白-3的表达与炎症因子和冠心病的相关性

李宁¹

（1.山西医科大学 第二临床医学院，山西 太原 030000）

【关键词】单核/巨噬细胞表面flTim-3；  可溶性Tim-3；  肿瘤坏死因子-α； 白介素-6；  冠心病

摘要：目的 探讨外周血CD14+单核细胞表面T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（full-length membrane-enchored T cell immunoglobulin and mucin-domain containing moleculesfamily-3）的表达、外周血清中可溶性T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（Soluble T cell immunoglobulin and mucin-domain containing moleculesfamily-3）与外周血清中TNF-α、IL-6及冠心病（CDH）的相关性。方法 196 例诊断初步考虑冠心病的患者为研究对象，其中54例经冠脉造影证实的非冠心病患者为对照组，稳定性心绞痛患者 87例，急性冠脉综合征患者 55 例为实验组，患者在发病入住我科时抽取外周血2管，采用流式细胞仪测量外周血单核细胞表面flTim-3的表达率，采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunoassay，ELISA）测量sTim-3、TNF-α、IL-6的浓度。结果 与非冠心病患者对照组比，稳定性心绞痛组、急性冠脉综合征组外周血CD14+单核细胞表面flTim-3、TNF-α、IL-6浓度增高，并且急性冠脉综合征组浓度更高，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与非冠心病患者对照组比，稳定性心绞痛组、急性冠脉综合征组sTim-3浓度降低，并且急性冠脉综合征组更低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。结论 冠心病患者外周血中CD14+单核细胞表面flTim-3的表达，与外周血中炎症指标呈正相关，冠心病患者血清中sTim-3的表达，与外周血中炎症指标呈负相关，且flTim-3、sTim-3的表达与冠心病患者的病情密切相关。

The correlation between the expression of  full-length membrane-enchored T cell immunoglobulin mucin⁃domain containing moleculesfamily-3（flTim-3）and the expression of the inflammatory factors with coronary heart disease.

LiNing¹

（1.Department of Cardiovascular Medicine of the second Hospital of Shanxi Medical University）

【Keywords】  flTim-3;  sTim-3;  TNF-α;  IL-6;  coronary heart disease

ABSTRACT: Aim  To investigate the expression of  full-length membrane-enchored T cell immunoglobulin mucin⁃domain containing moleculesfamily-3（flTim-3） on the surface of mononuclear cells in peripheral blood and the expression of Soluble T cell immunoglobulin and mucin-domain containing moleculesfamily-3（sTim-3）in peripheral serum with the expression of the inflammatory factors in peripheral serum and coronary heart disease.  Methods 198 patients suspected coronary heart disease were studied, including 87 patients with stable cardiac pain, 55 patients with acute coronary syndrome as experimental group, and 54 patients without coronary heart disease confirmed by coronary angiography as control group. Peripheral blood was taken from patients when they got sick and entered the cardiology department. Flow cytometry was used to measure the expression rate of flTim3 on the surface of  mononuclear cells in peripheral blood, and enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the concentration of sTim-3、TNF-αand IL-6 in peripheral serum.  Results  Compared with the control group of patients without coronary heart disease, the stable angina group and the acute coronary syndrome group had higher concentration of Tim-3、TNF-αand IL-6 in peripheral serum and higher expression rate of flTim-3 on the surface of mononuclear cells in peripheral blood.And the concentration in acute coronary syndrome group was higher.The difference was statistically significant ( p < 0.05 ).  Compared with the control group of patients without coronary heart disease, the stable cardiac pain group and acute coronary syndrome group had lower concentration of sTim-3 in peripheral serum. And the concentration in acute coronary syndrome group was lower.And the difference was statistically significant ( P<0.05 ). Conclusions  The expression of flTim-3 flTim3 on the surface of  mononuclear cells in peripheral blood of patients with coronary heart disease is positively correlated with inflammatory markers in peripheral serum.The expression of sTim-3 in the serum of patients with heart disease is negatively correlated with inflammatory markers in peripheral serum.and the expression of flTim-3 on the surface of  mononuclear cells in peripheral blood and sTim-3 in peripheral serum is closely related to the condition of patients with coronary heart disease.

冠心病是在我国的发病率逐年提高，尽管PCI术、溶栓、药物治疗已经在临床上广泛推广，但冠心病的患病率及致死率仍居高不下[1]，如何更有效的预防冠心病，仍需我们进一步研究。动脉粥样硬化斑块的形成是冠心病最重要的病理基础，越来越多的证据显示[2]：免疫反应介导的炎症改变参与了动脉粥样硬化斑块形成的各个阶段，单核/巨噬细胞是在参与动脉粥样硬化形成过程中最重要的免疫细胞，内皮细胞功能紊乱后，外周血循环中的CD14+单核细胞逐渐向内皮细胞靠拢并一步一步透过内皮细胞间隙迁移至内皮细胞下，在ox-LDL等刺激下释放大量炎症因子是促进动脉粥样硬化斑块形成及破裂的重要因素[3]。本临床研究进一步探讨冠心病患者CD14+单核细胞表面Tim-3（flTim-3）的表达率、血清中可溶性Tim-3（sTim-3）与TNF-α、IL-6及病情严重程度的相关性，以期可以找到抑制单核/巨噬细胞在参与动脉粥样硬化形成过程中释放炎症因子的新靶点。

资料与方法

1.1

一般资料 选择 2017年09 月至 2018 年 09 月山西医科大学第二医院拟诊冠心病患者194例为研究对象，都得到患者的同意并签署知情同意书，其中87例稳定性心绞痛患者，包括男 49 例，女 38 例，平均年龄（范围 42 ~ 78 岁）（55.76 ± 9.14）岁；55 例急性冠脉综合征患者，包括男 32 例 ，女 23例 ，平 均 年 龄（范 围 45 ~ 75 岁）（52.13 ± 10.23）岁；54 例非冠心病者（经冠状动脉造影证实）为对照组，包括男29例，女 25 例，平均年龄（范围 42 ~ 81 岁）（58.13 ± 11.35）岁。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）年龄≥ 42岁；（2）经 冠 脉造 影 证 实 至 少 在 左前降支、左回旋支 、右 冠 状 动 脉三支主要血管中有一支 狭 窄 程 度 大 于50%。排除标准：（1）有感染性疾病的患者；（2）有免疫功能紊乱的患者；（3）有风湿性疾病的患者；（4）有传染病的患者（5）有血液系统疾病的患者。

1.3

检测指标 入组所有患者在发病入住我院心内科时抽取外周血 2 紫管，用肝素抗凝，一管4000 r/min 离心 20 min，取上层血清采用 ELISA 法检测 TNF-α、IL-6、sTim-3的浓度， ELISA试剂盒买自英国Abcam公司；一管用流式细胞仪（德国Partec公司）检测CD14+单核细胞表面flTim-3的表达率， CD14+单核细胞flTim-3L试剂买自德国Partec公司。

1.4

统计学方法 采用 SPSS 20.0统计软件处理数据。计量资料以 x ± s 表示，多样本间的比较采用多样本的F方差分析，以 P < 0.05 为差异有统计学意义。

2

结果

2.1 3

外周血CD14+单核细胞flTim-3表达量、TNE-α、IL-6的比较 与非冠心病对照组比，稳定性心绞痛组、急性冠脉综合征组外周血单核细胞flTim-3表达率、TNE-α、IL-6浓度高，且急性冠脉综合征组浓度更高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。

2.2 3

外周血清sTim-3浓度的比较 与非冠心病对照组比，稳定性心绞痛组、急性冠脉综合征组外周血清较非冠心病患者组sTim-3浓度降低 ，且急性冠脉综合征组更低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 见表 1。

数据

表 1     3 组外周血单核细胞flTim-3表达率、外周血清 sTim-3、IL-6、TNF-α表达量的比较

Tab.1    Comparison of  the expression rate of flTim-3 in peripheral blood and the expression level of sTim-3、IL-6、TNF-α in peripheral serum of three groups

  注：1.2.3.组间进行比较，4.P < 0.05

讨论:单核/巨噬细胞是动脉粥样硬化斑块形成过程中的重要细胞，其分泌的趋化因子、炎症因子及蛋白酶等，对动脉粥样斑块形成起促进作用，在动脉粥样硬化炎症反应过程中发挥重要作用[4]。而且单核细胞来源的巨噬细胞是动脉粥样斑块中的主要免疫细胞成分。动脉粥样斑块内含有大量CD14+单核细胞、单核细胞源性的巨噬细胞及泡沫细胞等免疫细胞，而正常动脉内膜下几乎不含任何成分的免疫细胞，表明CD14+单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞参与动脉粥样硬化形成过程中，血液循环中的CD14+单核细胞在表达于内皮细胞表面的粘附分子及趋化因子与表达在循环单核细胞表面的相关受体作用下一步一步迁移到内膜下间隙，在巨噬细胞集落刺激因子和其他一些分化因子的驱动下，单核细胞可以转变为经典活化的巨噬细胞M1和替代型活化的巨噬细胞M2，M1型可被氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）或脂多糖（LPS）诱导产生，主要产生TNF-α、IL-6和活性氧(ROS)等，促进炎症的发生，加速动脉粥样硬化的形成；M2型巨噬细胞可进一步细分为M2a(白介素-4或白介素-13诱导产生)、M2b(免疫复合物、白介素-1P或LPS诱导)和M2c(白介素-10、转化生长因子或糖皮质激素可诱导)，被认为起到抑制免疫反应，抑制炎症，减缓动脉粥样硬化的形成[5]。然而经典活化的巨噬细胞占粥样硬化斑块中免疫细胞成分的大多数，替代型活化的巨噬细胞占少数，研究表明[6]在特定的细胞因子或某种药物作用下经典活化的巨噬细胞可以向替代型活化的巨噬细胞转化，但尚未发现某种药物可以促进这种转化，我们可能通过抑制典活化的巨噬细胞的促炎作用，达到减缓动脉粥样硬化的进程，经典活化的巨噬细胞迁移至内膜下后会吞噬沉积的脂质成分逐渐转变为泡沫细胞，在吞噬脂质过程中，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）等会促进巨噬细胞释放大量的细胞因子，如TNE-α、IL-6等[7]，这些细胞因子可引起巨噬细胞自身进一步聚拢，同时可以刺激巨噬细胞、平滑肌细胞、以及其他淋巴细胞来产生促炎因子，这些促炎因子促使局部动脉内膜炎症反应加剧，促进成纤维细胞增生并分泌细胞外基质逐渐形成纤维帽。

大多数活化的单核/巨噬细胞分泌白介素-6（IL-6）[8]、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）[9]，这些细胞因子具有广泛的调节机体炎症反应和免疫反应的作用，可通过复杂的细胞因子网络促进动脉粥样硬化斑块的形成和发展。

T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(Tim-3)是一种新型免疫调节分子，选择性表达于终末分化的Th1细胞上，负向调节Th1细胞所介导的免疫反应[10]。近年来研究发现Tim-3同样表达于多种固有免疫细胞表面，如单核细胞、巨噬细胞、树突样细胞等[11]。通过mRNA选择剪切作用可表达全长的膜型Tim-3（flTim-3）和可溶性Tim-3（sTim-3）,flTim-3由胞膜外的IgV区、粘蛋白区、跨膜区及胞质区组成，sTim-3缺少粘蛋白区及跨膜区，仅含IgV区及胞质区。研究表明[12 13]，flTim-3及sTim-3在单核/巨噬细胞中的调节作用与在Th1细胞中的作用不同，同时机体在不同的生理状态下及在不同的刺激因子作用下flTim-3调控单核/巨噬细胞的方式也不同。妇女在妊娠期间，flTim-3可诱导巨噬细胞活化并促进H202和NO的生成，提高机体抵抗力，清除侵入机体的病原菌；当TLR4通路被激活后flTim-3则负向调控巨噬细胞，抑制巨噬细胞的活化；Anderson AC等[13]发现flTim-3高水平表达于单核/巨噬细胞上，同时可以正向调节单核/巨噬细胞的活性及分泌不同的炎症因子，可以通过NF-kB通路促进单核/巨噬细胞炎性介质如IL-6、TNE-α等的释放。研究表明[14]：用脂多糖或氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导flTim-3过表达的RAW264.7细胞可促进其TNF-、IL-6的释放，用Tim-3阻断型抗体处理flTim-3过表达的RAW264.7细胞，封闭其flTim-3通路后，TNE-α、IL-6的释放的释放明显减少。用Tim-3融合蛋白体阻断从人外周血中磁选出的CD14+单核细胞后和用Ig处理从人外周血中磁选出的CD14+单核细胞相比较，Tim-3融合蛋白体处理组上清液中TNE-α、IL-6的浓度明显减少。可溶性sTim-3和单核细胞表面flTim-3在单核细胞、巨噬细胞调节过程中作用不同[15]，s Tim-3 可能通过与fl Tim-3 竞争性结合Tim-3配体（Tim-3L），而阻止 Tim-3L同 fl Tim-3 的结合，抑制单核/巨噬细胞的功能。

本临床研究采用了流式细胞法测量不同患者的单核细胞表面flTim-3的表达情况，采用ELISA法测量不同患者外周血中sTim-3、TNF-α、IL-6的表达情况，结果显示了冠心病患者中随着病情程度的加重，其外周血中单核细胞表面flTim-3、IL-6、TNF-α等炎症因子表达逐渐增加，且其表达显著高于对照组，但外周血中可溶性TIM-3的表达逐渐减少，且其表达显著低于对照组，本临床研究证实冠心病患者外周血中单核细胞表面flTim-3的表达，与外周血中炎症指标呈正相关，冠心病患者血清中sTim-3的表达，与外周血中炎症指标呈负相关，且其表达与冠心病患者的病情严重程度密切相关，提示flTim-3和sTim-3参与了动脉粥样硬化斑块的形成，Tim-3L与表达于单核/巨噬细胞flTim-3结合促进其炎症介质等的释放，加速动脉粥样硬化的形成。在动脉粥样硬化形成过程中，血清中sTim-3可通过竞争结合配体Tim-3L，抑制单核/巨噬细胞释放炎症介质等，从而减缓动脉粥样硬化的进程。

 冠心病患者中诸多危险因素如冠心病家族史、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟等，可能通过某种调节机制导致单核细胞表面flTim-3的高表达、外周血中的sTim-3低表达，而这种Tim-3的表达方式加速了动脉粥样硬化斑块的形成，Tim-3可能成为冠心病治疗的一个新靶点，但本临床研究未能阐明flTim-3和sTim-3参与动脉粥样硬化斑块形成过程中起调节的具体机制，需要我们进一步去研究。

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