经腹入路与经腹膜外入路纤维环穿刺法建立兔腰椎间盘退变模型的比较研究

温亚枫，刘浠，易威威，叶禾，刘渤^*

重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016

【摘要】目的:探讨经腹入路和经腹膜外入路纤维环穿刺法建立兔腰椎间盘退变模型，分析两种入路方式所致椎间盘退变的效果和各自特点。方法：新西兰大白兔20只，雌雄不限，随机分为A、B两组，每组10只，A组为经腹入路纤维环穿刺组，B组为经腹膜外入路纤维环穿刺组，用18G穿刺针穿刺腰3/4、腰4/5、腰5/6 椎间盘, 深度控制在5mm，以腰2/3、腰6/7椎间盘作为自身正常对照。对两种入路方式在手术时间、出血量、节段定位等方面进行比较，术前、术后4周、8周分别对造模动物腰椎行MRI 检测,并将标本取出行HE染色、阿辛蓝染色和免疫组织化学检测。结果：A组手术暴露时间（23.4±4.43）min,手术总时间（45.5±5.85）min，出血量（1.05±0.50）ml；B组手术暴露时间（60.7±7.30） min，手术总时间（96.7±6.33）min，出血量（6.2±1.87）ml，两组间各统计指标均有显著统计学意义（P＜0.01）。术后4周，A、B两组穿刺椎间盘MRI T2加权像示髓核信号减弱并伴高信号区面积缩小，术后8周髓核信号进一步降低，髓核与纤维环分界不清。HE染色可见髓核细胞数量减少，纤维环排列紊乱；阿辛蓝染色见蛋白多糖含量显著降低，免疫组织化学检测Ⅱ型胶原表达量明显减少。结论：两种手术入路方式均能成功构建兔腰椎间盘退变动物模型，但在手术时间、出血量、节段定位等方面，经腹入路均明显优于经腹膜外入路, 是一种操作简单、快捷而又高效的椎间盘退变动物模型构建新方法。

【关键词】动物模型；腰椎间盘退变；经腹入路；经腹膜外入路；纤维环穿刺

【中国图书分类法分类号】R683.2           【文献标志码】A

A comparative study of the establishment of rabbit lumbar disc degeneration model by annulus puncture through retroperitoneal approach and transventral approach

WEN Ya-feng，LIU Xi，YI Wei-wei，YE He，LIU Bo

Department of Orthopedics，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016

【Abstract】Objective：To investigate the effect and characteristics of the two methods induced by annulus puncture through retroperitoneal approach and transventral approach. Methods：Twenty healthy New Zealand white rabbits , male or female, were randomly divided into A and B two groups（n=10）, group A through transabdominal approach, group B through retroperitoneal approach。The L3/4、L4/5、L5/6 discs in each rabbit were punctured with 18G needle，the depth of the needle stab was controlled at 5 mm, L2/3 、L6/7 discs as normal control. The two approaches were compared in surgical time, blood loss, segment orientation etc. MRI of the lumber spine were repeated before and at 4 and 8 weeks after surgery, tissue samples were harvested for HE staining、Alcian blue staining and immunohistochemical detection. Results：Group A average exposure time was (23.4 ± 4.43)min, mean operative time was (45.5 ± 5.85) min, average blood loss was (1.05 ± 0.50)ml ;group B average exposure time was (60.7 ± 7.30) min, operation time was (96.7 ± 6.33) min ,average blood loss was (6.2 ± 1.87) ml, each statistical indexes between the two groups have significant statistical significance.4 weeks after the surgery，the punctured segments both in A and B groups were seen nucleus signal impaired with a narrower range of high signal area in MRI T2-weighted images, at 8 weeks after operation, nucleus signal was further reduced, the boundaries of nucleus pulposus and annulus was unclear. HE staining observed reduction in the number of nucleus pulposus cells and annulus fibrosus became disorganized; Alcian blue staining showed significant reduction in proteoglycan content；immunohistochemistry chemical examination showed type Ⅱ collagen content was significantly decreased. Conclusion：Both methods can successfully construct rabbit lumbar disc degeneration models, but in terms of the operative time, blood loss, segmental orientation, the transabdominal approach was much better than the retroperitoneal approach, this is a simple, fast and efficient new method of intervertebral disc degeneration animal model building.

【Key words】Animal model；Disc degeneration disease；Transabdominal approach；Retroperitoneal approach；Annulus puncture

椎间盘退变是引起脊柱退行性疾病的重要原因之一，其具体发生机制尚未完全阐明^[1]。近年来针对椎间盘退变机制的研究，出现了许多新的方法，如生长因子注射^[2]，基因转染^[3]，细胞移植^[4]以及组织工程学^[5]等，因此选择一种操作简单、快捷而高效的动物椎间盘退变模型构建方法就显得尤为重要。目前以Masuda等^[6]提出的经腹膜外入路纤维环穿刺法构建椎间盘退变动物模型应用最广泛，但其缺点亦较明显^[7]，如手术时间较长，术中出血量较大，椎间盘暴露相对困难以及术中节段定位欠佳等。故本实验拟采用纤维环穿刺法分别经腹入路和经腹膜外入路建立兔腰椎间盘退变模型，对两种入路方式的手术时间、出血量、节段定位、术后恢复以及穿刺节段椎间盘影像学和病理学变化等方面进行比较，希望找到一种安全、简单、快速、有效的方法，为腰椎间盘退变动物模型构建提供最佳入路选择。

1 材料和方法

1.1主要试剂与动物分组

1.1.1 主要试剂 戊巴比妥钠（上海桥星贸易有限公司），18G穿刺针（上海埃斯埃医械塑料制品有限公司），注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司），Ⅱ型胶原抗体（博奥森生物试剂公司）。

1.1.2 动物分组 经MRI检查排除脊柱先天畸形及椎间盘退变的3月龄健康新西兰大白兔20只，雌雄不限，体重2.0-2.5kg，由重庆医科大学动物实验中心提供。手术分组：随机分为A、B两组，每组10只；A组为经腹入路纤维环穿刺组，B组为经腹膜外入路纤维环穿刺组。

1.2 动物模型构建

1.2.1 术前准备 术前禁饮食8小时；动物称重，3%戊巴比妥钠溶液1ml/kg耳缘静脉注射麻醉。麻醉成功后，摆好体位，绷带固定、备皮及常规消毒铺巾，术前15分钟青霉素钠20万单位肌肉注射预防感染。

1.2.2 模型构建过程  A组取仰卧位，腹正中切口，切口长约8cm，逐层切开至腹腔。小心将肠管向右侧翻出并用纱布覆盖，暴露出左侧腹腔，可见左肾静脉与下腔静脉交汇处，此处平对第三腰椎，以此为定位标志，其下方第一个椎间盘即为L3/4椎间盘，小心分离椎体前方肌肉，依次暴露出L3/4、L4/5、L5/6椎间盘，用18G穿刺针于纤维环前方中点平行终板刺入纤维环，深度5mm，维持5s拔出穿刺针，可见髓核组织沿穿刺孔道漏出，穿刺成功后逐层缝合，碘伏擦洗皮肤并覆盖敷料（图1）。B组取右侧卧位，沿左侧第十二肋与髂嵴间连线取长约10cm切口，逐层切开至背最长肌与腹外斜肌分界处，于此处切开深筋膜并钝性分离，直至可触摸到横突，沿横突继续分离肌肉组织直到暴露出L3/4、L4/5、L5/6椎间盘，用18G穿刺针于纤维环左侧平行终板刺入纤维环，深度5mm，维持5s拔出穿刺针，可见针尖处带出少量胶冻状髓核组织，穿刺成功后逐层缝合，碘伏擦洗皮肤并覆盖敷料（图2）。

图1 经腹入路术中操作

Fig.1 Transventral approach in operation

*即为肾静脉与下腔静脉交汇处，以此为定位标志

图2 经腹膜外入路术中操作

Fig.2 Retroperitoneal approach in operation

1.2.3术后处理 动物清醒后放回饲养笼，术后当天禁饮食。术后第1天起给予正常饮食，术后连续3天给予青霉素钠20万单位肌注预防感染，定期换药。注意观察动物的饮食、四肢活动、大小便及手术切口愈合情况。

1.3 两种入路手术各项指标对比

    参与手术操作人员均熟练掌握两种入路手术方式，将两种入路方式在手术时间、出血量、节段定位等方面进行比较。

1.4 椎间盘退变检测指标

1.4.1 MRI检测 分别于术前、术后4周、8周在A、B两组中分别随机抽取3只动物行磁共振检查（SIEMENS 3.0T MRI），根据改良Thompson分级法评估不同入路穿刺节段椎间盘是否发生退行性改变及有无明显差别。

1.4.2组织学观察  8周后，从A、B两组中分别随机抽选3只动物，处死后将腰椎完整取出，观察穿刺节段椎间盘和正常椎间盘的外形变化，切开椎间盘观察纤维环和髓核组织的变化情况。将穿刺节段L5/6椎间盘与对照节段L6/7椎间盘取出，用4%多聚甲醛固定48h，10% EDTA脱钙21d，石蜡包埋，5μm厚度连续正中矢状面切片，行HE染色，阿辛蓝染色，倒置显微镜下观察髓核细胞及纤维环的形态学变化。

1.4.3 免疫组织化学法检测  将上述切片依次浸泡于二甲苯、酒精中脱蜡至水；0.1%胰蛋白酶抗原修复30min；3%H₂O₂封闭10min；Ⅱ型胶原一抗4℃孵育过夜；Ⅱ型胶原二抗室温孵育45min；DAB显色；中性树胶封片后显微镜下观察并拍照记录。所得结果用IPP 6.0软件检测并行半定量分析。

1.5 统计学分析

实验数据用SPSS19.0统计学软件处理。符合正态分布的数据以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，MRI结果采用等级资料的秩和检验，免疫组化半定量分析结果采用两独立样本秩和检验，检验水准α=0.05。

2.结果

20只动物模型均构建成功。术后动物饮食、精神、大小便及四肢活动可。均未出现肢体瘫痪、肠梗阻、感染等并发症，经MRI检测，术后8周内各穿刺节段均出现不同程度退变。

2.1  两种入路手术各项指标对比

   A组的平均暴露时间、手术时间及出血量与B组相比较明显降低，两种入路方式在目的节段暴露时间、手术总时间及出血量均有显著统计学意义（P＜0.001），具体见表1 。

表1 各项手术指标对比

Table.1 Operation index comparison

^a与A组相比p＜0.001

2.2 MRI检查结果

   术后4周，A、B两组穿刺节段L3/4、L4/5、L5/6 椎间盘髓核信号轻度减弱伴有高信号区面积缩小；术后8周，髓核信号进一步降低，髓核与纤维环分界不清（图3）。两种入路方式穿刺节段椎间盘均出现较明显退变，根据改良Thompson分级法评估达到Ⅱ级～Ⅳ级(表2),但两组间无明显统计学差异。

图3 两种入路方式不同时间点MRI图像

Fig.3 MRI images of two kinds of approach at different time points

表2 两种入路方式不同时间点MRI改良Thompson 分级情况

Table.2 Modified Thompson scoring for two kinds of approach at different time points

2.3组织学观察

大体观察：正常椎间盘表面光滑平坦，穿刺节段椎间盘穿刺处有明显骨赘形成。将其切开后，正常椎间盘外周纤维环排列规则有序，中央髓核组织丰富而饱满，呈胶冻状，两者界限清晰；而穿刺椎节段椎间盘外周纤维环排列紊乱，中央髓核组织明显减少，两者界限模糊不清。

HE染色：正常椎间盘中央含大量髓核细胞，形态一致呈单个或多个点状散在分布，排列均匀，细胞外基质丰富，外周纤维环呈同心圆层状排列，井然有序；穿刺节段术后8周髓核细胞坏死、崩解，数量减少且成团聚集，部分髓核组织被增生的结缔组织所代替，细胞外基质明显减少，外周纤维环结构紊乱，层状结构中断并向内塌陷（图4）。

图4 两种入路方式穿刺后椎间盘HE染色

Fig.4 HE stainning of two kinds of approach

正常髓核 ×40             正常髓核 ×100               正常纤维环 ×40

A组髓核 ×40               A组髓核 ×100             A组纤维环 ×40

B组髓核 ×40               B组髓核 ×100             B组纤维环 ×40

阿辛蓝染色：阿辛蓝染色可特异性将酸性粘多糖染成蓝色，在正常椎间盘髓核组织周围含有丰富的蛋白多糖呈弥漫性分布，而穿刺节段术后8周可见髓核组织周围蛋白多糖含量显著下降。（图5）

图5 两种入路方式穿刺后椎间盘阿辛蓝染色

Fig.5 Alcian blue stainning of two kinds of approach

     正常髓核 ×200                A组髓核 ×200               B组髓核 ×200 

2.4 免疫组化检测

术后8周，A、B两组L6/7正常椎间盘髓核组织中髓核细胞呈单个或多个散在分布，排列规则，Ⅱ型胶原染色呈强阳性均匀分布于髓核细胞周围；而无论A组或B组其穿刺节段L5/6椎间盘髓核区髓核细胞成团聚集，分布散乱，Ⅱ型胶原表达较正常对照组减少，着色明显较淡，与其正常组织相比有显著统计学差异，但A、B两组间比较无明显统计学意义（图6、表3）。

图6 两种入路方式穿刺后椎间盘Ⅱ型胶原免疫组化

Fig.6 Type Ⅱ collagen immunohistochemistry of two kinds of approach                        

       A组正常 ×200                               A组退变 ×200            

              B组正常 ×200                               B组退变 ×200     

表3 各组Ⅱ型胶原平均吸光度值

Table.3 Average positive absorbance of TypeⅡ collagen in each group

^a与A组正常相比p＜0.05，^b与B组正常相比p＜0.05

2.讨论

椎间盘退变性疾病可引起病变椎间盘在形态学、生物学以及生物化学等多方面发生改变。其具体机制尚未完全阐明，也成为近年来的研究热点^[8]。因此，如何快速、安全、准确的建立椎间盘退变动物模型对其机制研究至关重要。理想的椎间盘退变动物模型应包含以下特点^[2]：1.解剖结构与生物力学等方面与人类相近；2.可高度重现椎间盘退变的病理过程；3.良好的可靠性和易重复性；4.经济性和便捷性。兔因其来源广泛、价格适宜、操作方便，同时仍可较好地重现椎间盘退变的客观规律，且在手术耐受性、抗感染能力及后期髓核组织提取和细胞培养等方面明显优于鼠，是较理想的动物模型^[9]，也是本实验后续研究最为理想的选择，故本研究以兔作为建模对象。在建模方法上，国内外报道的方法繁多，近年来出现了许多微创手术方式，如C臂透视下纤维环穿刺^[10]、CT引导下纤维环穿刺^[11]、透视下蛋白片段注射^[12]及CT引导下终板穿刺合并药物注射^[13]等，但其均需大型特殊设备支持及熟练掌握微创操作等亦限制了其应用。目前仍以Masuda及Moss^{[6, 14]}等提出的经腹膜外入路纤维环穿刺法应用最为广泛^{[15, 16]}。

椎间盘退变过程中的主要病理改变为Ⅱ型胶原含量下降，蛋白多糖含量减少及髓核组织水分的丢失^[17]，为了检验本研究中所采用的两种不同入路方式所建立的动物模型是否成功，我们选择了MRI进行检测验证，MRI是目前公认的检测椎间盘是否发生退变的影像学首选方法^[18]，其准确度高、显像效果好，特别是T2加权像，能够较好的反映出椎间盘中水分和蛋白多糖含量的变化情况^[19]，可实现对椎间盘退变初期的检测。近年来有学者提出MRI T1ρ自旋锁定成像与T2-mapping 技术可量化分析椎间盘中蛋白多糖和胶原蛋白的含量^{[20, 21]}，可对椎间盘的退变程度做出更准确的评估。从MRI图像可观察到本实验中无论A组或B组，其穿刺节段椎间盘在4周、8周均出现不同程度退变。同时，我们取出两种入路方式穿刺的椎间盘及相邻正常椎间盘标本进行了大体观察对比以及HE染色、阿辛蓝染色和免疫组织化学的检测，所得到的结果与Kääpä等^[22]报道的椎间盘退变组织学变化结果相似，进一步证实两种入路方式均能成功构建椎间盘退变模型。

经腹膜外入路纤维环穿刺法是目前椎间盘退变模型构建最常用方法，因其有良好的可重复性，可准确控制穿刺深度和角度，但其仍存在不足，如手术时间较长，术中出血量较大，椎间盘暴露相对困难以及术中节段定位欠佳等^[7]。在本研究中，B组手术时间较A组明显延长达（96.7±6.33）min，大量时间花费在目的椎间盘的暴露及定位上，虽可通过兔髂前上棘和第十二肋骨进行粗略体表定位，但在实际手术操作中因动物的体位选择、体型大小、解剖结构个体差异等干扰因素存在，定位仍较困难；开放性手术切口较大，经腹膜外入路需要对肌肉进行剥离甚至剪除横突，出血量较多，达（6.2±1.87）ml。随着近几年来各种新颖治疗方式的出现，更需对动物模型行二次手术干预，定位不准确将给手术带来较大困难甚至失败，本研究找到一处相对可靠的解剖定位标志—左肾静脉与下腔静脉交汇处，可在术中对椎间盘进行较准确定位。左肾静脉与下腔静脉交汇点平对腰3椎体，其下方第一个椎间盘即为L3/4椎间盘。本研究所采用的经腹入路纤维环穿刺法手术时间短（45.5±5.85）min，出血量少（1.05±0.50）ml，极大的缩短了手术时间，减少了术中出血，使椎间盘暴露更清楚，穿刺更准确，造模成功率及动物存活率均较高。当然，本研究亦有不足之处，经腹入路可能会对动物胃肠功能造成一定影响，切口愈合后肠系膜可能会产生不同程度黏连影响二次手术操作，仍不能百分百模拟人椎间盘退变性疾病病理变化过程。

综上所述，两种入路手术方式均能成功建立椎间盘退变动物模型。但相较而言，经腹入路纤维环穿刺法手术操作简单，视野暴露清楚，利于穿刺；手术时间短，术中出血量少；有明确的解剖学定位标志，术中定位准确。经本研究证实，经腹入路纤维环穿刺法是一种操作简单、快捷而又高效的椎间盘退变动物模型构建方法，可为椎间盘退变机制的研究提供良好的实验载体。

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