疫苗生产中多种不同物品同载进行脉动真空灭菌验证效果分析

王舰兵¹，金鑫¹，张可明²，张宇¹，柳琦¹，贺亮¹，张旭¹，崔云龙¹，王云英²

1. 长春祈健生物制品有限公司，吉林长春   130012；

2. 长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春 130012

摘要  目的   评价在疫苗生产过程中不同种物品同载进行脉动真空灭菌验证效果的安全性。 方法  用专业温度探头、生物指示剂通过化学和物理方法对同载的不同物品进行脉动真空灭菌验证效果分析和评价。 结果  脉动真空灭菌器经过空载保压试验和B-D试验确认灭菌器性能合格后，将疫苗生产中常用的硅胶管道、橡胶栓、过滤器、超声破碎仪、玻璃吸管、洁净服、止血钳等按照规定的点位放入灭菌器内进行132℃、8min灭菌程序。经过热穿透试验、微生物挑战试验和灭菌后物品无菌试验的检测结果证明灭菌效果均小于无菌保证水平（APL≤10^-6）符合现行GMP的要求。 结论  疫苗生产中常用的多种物品是可以用脉动真空灭菌器同时进行132℃、8min灭菌，且完全达到规范要求。

关键词   脉动真空； B-D试验；验证效果；微生物挑战试验；无菌保证水平

Analysis of the effect of pulsating vacuum sterilization on different

items in Vaccine production

WANG Jian-bing，JIN Xin，ZHANG Ke-ming,ZHANG Yu，LIU Qi，HE Lyang，ZHANG Xu，Cui Yun-Long，WANG Yun-ying

1. Changchun Keygene Biological Products Co. Ltd.，Changchun 130012.Jilin Prouince,China

2. Changchun Lnstitute Of Biological Products Co. Ltd.，Changchun 130012.Jilin Prouince,China

Abstract:   Objective   To get the evaluation of the safety of pulsating vacuum sterilization of different kinds ofobjectsin the process of vaccine production. Method  The effect of pulsating vacuum sterilization was analyzed and evaluated by means of chemical and physical methods with professional temperature probe and biological indicator. Results  The commonly used silicone tubes, rubber plugs, filters, ultrasonic breakers, glass straws, clean clothes, hemostatic forceps and so on were placed in the sterilizer for sterilization procedure(132 ℃ for8min)according to the rules after the function of the pulsating vacuum sterilizer being confirmed qualified by no-load holding test and B-D test. And it met the requirements of current GMP standard that the results of thermal penetration test, microbial challenge test and sterilizing test all showed that the sterilization effect was lower than that of aseptic guarantee level(APL≤10-6）.Conclusion  A variety of items commonly used in vaccine production can be sterilizedtogetherat 132 ℃ and 8min simultaneously with pulsating vacuum sterilizer, and the effect can completely meet the standard requirements.

Key words:  pulsating vacuum；B-D test；effect of validation；microbial challenge test；aseptic assurance level

高压灭菌器使物品灭菌后达到无菌要求，这是药品生产中的一个基本保证。^［1］ 高压灭菌器灭菌效果验证是最关键的首要步骤，同时在制药行业的发展历程中，验证是GMP不断创新发展的里程碑，是质量管理体系持续稳定运行的必要基础，是更为高级的质量方法。^［2］ 现在多数制药行业已放弃了老式的下排汽高压蒸汽灭菌器而采用了安全性可靠、灭菌速度快、干燥效果好等、智能程度高的脉动真空灭菌器来进行无菌保障。本文以脉动真空湿热灭菌器验证为出发点，根据药品生产企业在质量控制中对无菌的要求，开展多种不同物品同时用脉动真空湿热灭菌器进行灭菌效果的验证分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

灭菌对象是疫苗生产中常用的硅胶管道、盐水瓶、橡胶栓及离心杯盖和2L-PC瓶盖、柱式过滤器、超声破碎仪、取样玻璃刻度吸管、洁净服、止血钳、离心杯、肖特瓶等。

灭菌器为山东新华医疗器戒股份有限公司生产的脉动真空灭菌器（XG1.DTF-1.5B型）及设备自带的温度∕压力记录仪和后安装的日本横河电机株式会社出品的SR10000温度曲线自动记录仪。

灭菌验证效果所用的器材包括无线温度记录器；Ebro温度验证仪；Ebro压力验证仪；132℃压力蒸汽灭菌化学指示卡；BD试验真空测试图；自含式脉冲管生物指示卡，指示菌为嗜热脂肪芽孢杆菌（ATCC7953）；无菌检验培养基为硫乙醇酸盐培养基。

1.2 试验方法

1.2.1 灭菌器性能验证 ①真空保压试验：确认空载状态下在灭菌器腔室内放置1个压力探头，启动脉动真空灭菌器保压程序，参数设定：保压限度:-93 KPa,时间:900 s，泄露限度: ≤2 KPa。结果判定，若900 s后初始压力≤-93kPa、泄露率≤2Kpa/15min，则视为设备保压合格。②B-D试验：在脉动真空灭菌器空载状态下，将B-D测试包放在排气口上方约20cm处（勿盖住排气口），标签向上。设定B-D程序参数：脉动上限+75Kpa，脉动下限-75Kpa脉动3次，真空脉动压力下限设为 －80Kpa ，灭菌温度132℃，维持灭菌时间为4min，完成灭菌运行程序后，取出测试包并打开观察B-D指示图。结果判定，若B-D指示图上的比色条均匀变为设计的颜色，说明此脉动真空灭菌器排除冷空气彻底，灭菌器性能合格。③空载热分布试验：脉动真空灭菌器在空载条件下，将经过校验的14个Ebro自动温度/压力记录仪，按几何分布放于灭菌器的腔室内，并要确认记录仪位置均距离灭菌器腔室四壁≥5cm，另布置一个记录仪在疏水口附近（是否应有图？1）。。设定 记录仪的数据记录频率为10s/次，启动设备的同时启动记录仪。选择132℃、8min、脉动±75kpa灭菌程序启动灭菌器进行试验。灭菌程序结束后，记录每个点的温度值。结果判定，若在灭菌段同一时间不同布点之间的温度差别（一致性）≤2℃，且灭菌器温度主控制探头与数字记录仪、曲线记录仪温度差值均小于1℃。测试的各点温度值基本一致，则可确认灭菌腔内温度分布均匀；否则存在“冷点”并记录“冷点”的位置和温度滞后时   间。④满载热穿透试验：灭菌器装载待灭菌物品达到满载条件，将经过校验的14个Ebro自动温度/压力记录仪，按照不同种类物品和不同的位置布放于灭菌物品内，呈现几何形状分布放于灭菌器的腔室内，并要确认记录仪位置均距离灭菌器腔室四壁≥5cm（图1），另布置一个记录仪在疏水口附近（是否应该有探头布点图？）。设定记录仪的数据记录频率为10s/次，启动设备的同时启动记录仪。选择132℃、8min、脉动±75kpa灭菌程序启动灭菌器进行试验。灭菌程序结束后，结果判定，若所测试的各点F0≥15min，则灭菌器在满载条件下 满足灭菌要求。

图1  记录仪布点示意图

1.2.2生物挑战试验验证  灭菌器装载待灭菌物品达到满载条件，在满载热穿透试验布放14个记录仪，按着满载热分布试验所测试的每个点位的不同物品中布放１份生物指示剂（留阳性对照置于灭菌器外）。进行常规灭菌程序运行１个灭菌周期， 待灭菌程序结束后，取出生物指示剂。将灭菌后的生物指示剂和阳性对照的生物指示剂在55～56下培养24h，观察结果。结果判定：经灭菌后的生物指示剂管内培养液颜色呈现紫色，（说明书给定的灭菌后合格颜色）即为培养阴性（－），同时阳性对照生物指示剂管内培养液为黄色，即培养阳性（＋），判定灭菌效果验证合格。若实验组生物指示剂有１支或大于1支的管内培养液仍为黄色，则判定灭菌效果验证不通过，验证实验失败。

1.2.3 无菌试验  在灭菌效果验证合格的灭菌物品中，分别抽取离心杯、2L-PC瓶盖、肖特平瓶、橡胶栓、翻帽栓、硅胶管、玻璃吸管等样品备用，无菌实验操作在百级洁净环境进行，由具有微生物检验资质的人员负责操作。灭菌物品采样用淋洗水取样法，将淋洗后的取样水注入到硫乙醇酸盐流体培养基中， 并将培养基放置于35℃培养箱中培养3h，观察结果。结果判定，所有接种的标本在重复3次试验中均无菌生长，则判定灭菌验证通过。

2  验证结果

2.1 保压试验结果

结果表明脉动真空灭菌器保压程序停止900 s后，初始压力仍≤-93kPa、泄露率≤2Kpa。因此该设备没有泄露，保压试验成功。

2.2  B-D试验结果

实验结果表明，在空载条件下，脉动上限+75Kpa，脉动下限-75Kpa灭菌温度132℃，维持灭菌时间为4min，完成灭菌运行程序后，取出测试包并打开观察 B-D指示图显示颜色变成黑色且颜色分布均匀，证明脉动真空灭菌器能够排除空气并且蒸汽渗透充足。因此B-D抽真空试验成功，该灭菌器 冷空气排除彻底，性能验证通过。

2.3  空载热分布试验结果

结果表明，灭菌器腔内不存在冷点，且在灭菌段同一时间不同布点之间的温度差别（一致性）≤2℃，灭菌器温度主控制探头与数字记录仪、曲线记录仪温度差值均小于1℃。说明此设备本次空载热分布试验合格，验证通过。

2.4  满载热穿透试验结果

满载热穿透试验表明，脉动真空灭菌器在选择132℃、8min、脉动±75kpa灭菌程序灭菌后，在灭菌段同一时间 不同布点之间的温度差别（一致性）≤2℃，在灭菌段所有热穿透的记录仪数值的Fo值≥15，并且高压灭菌指示剂颜色变为黑色，与说明书上给定的合格颜色一致。证明该设备本次满载热穿透试验合格。  

2.5  生物挑战试验试验结果

验证试验结果表明，经脉动真空蒸汽灭菌器常规灭菌程序灭菌后的所有生物指示剂管内培养结果均为无菌生长（阴性），阳性对照生物指示剂管内培养结果均为有菌生长（阳性）。该灭菌器不同种物品同载进行脉动真空灭菌验证效果通过验证。

2.5  无菌试验结果

无菌试验结果表明，对离心杯、2L-PC瓶盖、 肖特平瓶、橡胶栓、翻帽栓、硅胶管、玻璃吸管等物品的取样水进行检测，35℃培养箱中培养3h培养基中没有菌落生长，故无菌试验通过验证。

3  讨论

本研究通过进行B-D抽真空试验、空载热分布试验、满载热穿透试验、微生物挑战试验和无菌试验，证明了脉动真空灭菌器在选择132℃、8min灭菌程序的条件下，灭菌效果合格，符合现行GMP的要求。 同时，通过这些试验，不但证明了脉动真空灭菌器设备本身的可靠性，而且还对灭菌程序进行了验证，保证了灭菌效果的有效性。^［3］ 目前，我国部分企业仍然沿用下排气式压力蒸汽灭菌器 121℃、30min；121℃、15min以及 116℃、40min程序进行灭菌，^［4］升温和灭菌时间相对较长；湿包现象较为严重。本研究根据疫苗生产企业中对灭菌物品多样化的具体特点进行了具体分析，采用了多种物品同载用脉动真空灭菌器（对于非液体类的）选用132℃、8min灭菌程序试验，试验结果表明不仅安全性能够得到保障，而且灭菌时间短、灭菌效果可靠、干燥效果好，^［5］提高了工作效率，可以在疫苗企业生产中以及医疗行业中得到推广应用。

    当然也可采用其他温度和时间参数，但无论采用何种灭菌温度和时间参数，都必须证明所采用的灭菌工艺和监控措施在日常运行过程中能确保物品灭菌后的SAL≤10^-6 。^［3］同时要严格按着验证过程中的包装方式和装载位置进行包装和装载。而且摆放不能排列过密，以保证灭菌的有效性和均一性。^［3］

总之验证是药品生产企业中与质量安全关系密切的重要内容，而脉动真空灭菌器的验证作为疫苗生产中的关键性验证项目，无论是选择132℃灭菌法还是选择其他的灭菌方法灭菌都要严格按照现行版药典的要求进行验证，这也是对疫苗生产质量的重要保障。

参 考 文 献

﹝1﹞ 纪邵梅，赵宏大．高压蒸汽灭菌器灭菌效果的验证方法［Ｊ］.中国药事杂志,2004，18（5）：328-329.

﹝2﹞ 何国强．制药工艺验证实施手册： 2012年版［Ｍ］．北京：化学工业出版社， 2012．

﹝3﹞ 国家药典委员会．中华人民共和国药典：三部 ［Ｍ］．北京：中国 医药科技出版社， 2015．  

﹝4﹞ 马延明，杨勇，王涛，等．无热源蒸汽灭菌在疫苗生产中的应用 与效果验证［Ｊ ］．微生物学免疫学进展， 2009， 37（１）： 26－29．

﹝5﹞ 刘晓霞，闫虹.20家医疗机构压力蒸汽灭菌器灭菌效果检测分析［Ｊ］.实用医技杂志，2018，25（7）：748-749.

﹝6﹞ 王舰兵，李铎，等. 132℃灭菌法在疫苗生产中的灭菌效果验证［Ｊ］.中国消毒学杂志，2017，34（5）：419-421.