鼠尾草酚对Con A诱导肝损伤的保护作用及机制研究

孙璐，曹利军a，陈立建

（安徽医科大学，安徽合肥，230000）

[摘要] 目的 本实验旨在研究鼠尾草酚对ConA诱导肝损伤小鼠是否有保护作用并探讨其可能的作用机制。 方法 利用ConA诱导肝损伤模拟自身免疫性肝损伤，将小鼠随机分为4组：A组为生理盐水对照组（NS组）、B组为鼠尾草酚对照组（Carnosol组）、C组ConA对照组（ConA组）、D组鼠尾草酚保护组（Carnosol/ConA组），检测各组小鼠外周血谷草转氨酶（AST），谷丙转氨酶(ALT)水平，HE染色观察小鼠肝组织坏死程度。然后流式细胞仪检测外周血、肝脏组织及脾脏组织CD4+淋巴细胞计数的变化，PCR法测定肝脏组织TNF-α、IFN-γ、IL-6、NF-κB的mRNA表达，Westernblot法测定肝脏组织p65、IκBα磷酸化水平。 结果 鼠尾草酚预处理显著降低了ConA诱导肝损伤小鼠血清转氨酶升高，改善肝损伤和抑制炎性细胞因子的表达，抑制了NF-κB的活性，并且减少了小鼠外周血及脾脏中CD4+淋巴淋巴细胞计数。 结论 鼠尾草酚通过下调肝脏NF-κB的表达，进一步抑制炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的分泌及CD4+淋巴淋巴细胞的浸润，从而减轻肝脏组织的炎症。

[关键词] 鼠尾草酚；肝损伤，炎症因子，T淋巴细胞； 

Study on protective effect and mechanism of sage phenols on Con A induced liver injury
     Sunlu, Caolijun, Chenlijian
     (Anhui Medical University, Hefei, Anhui, 230000)
[Original: English] Summary] Objective To investigate the protective effect of sage phenols on Con A induced liver injury in mice and to explore its possible mechanism. [Abstract] Objective To study the protective effect of sage in Con A induced liver injury mice and explore the possible mechanism of it. Methods ALnofen was used to simulate autoimmune liver injury in mice with Con A induced liver injury. HE staining observed the degree of liver necrosis in mice. The CD4 +, CD8 + T lymphocyte count in peripheral blood, liver tissue and spleen tissue was then measured by flow cytometry. PCR method was used to determine TNF-alpha, IFN-gamma, IL-6, ICAM-

  由各种原因引起的急性与慢性肝脏疾病仍然是威胁人类健康的主要问题，免疫介导机制在其中起了核心作用并决定疾病的转归^[2-5]。抑制过度的免疫反应或直接防止肝细胞的损伤，可能对肝脏疾病治疗起到有益的作用^[12]。鼠尾草酚（carnosol）是一个酚醛二萜，具有较强的抗辐射、抗氧化、抗癌作用。本实验利用Con A诱导肝损伤模拟自身免疫性肝损伤，观察Carnosol对Con A诱导肝损伤小鼠是否有保护作用并探索其可能的作用机制。报道如下。

l 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 动物 选取C57BL雄性小鼠，年龄6-8周，体重25g左右，购自宁波大学医学院实验动物中心。小鼠被安置在无病原体的条件下，并免费获得食物和水。所有实验均按照实验动物护理和使用指南进行。

1.1.2 主要仪器 全自动生化分析仪（日本OLYMPUS光学株式会社）、Cut6062-全自动旋转式石蜡切片机（德国SLEE公司）、ABI PRISM 7000 PCR分析仪（美国应用生物系统公司），流式细胞仪（德国美天旎生物技术公司）。

1.1.3 主要试剂  ConA试剂（美国sigma公司），鼠尾草酚carnosol试剂，anti-mouse CD4⁺ antibody(APC)（美国eBioscience公司），ELASA试剂盒（美国R＆D公司），RT-PCR试剂（日本TakaRa公司），IκBα抗体、phospho-IκBα抗体、NF-κB p65抗体、phospho-NF-κB p65抗体，Anti-rabbt antibody (code:7074s) ，Anti-mouse antibody (code:7076s)， actin(code:4970s)（美国CST公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 药物的配置  

精密天平称取鼠尾草酚 （Carnosol）5mg，加入5ml 3％的二甲基亚砜（MDSO）溶解稀释。得到Carnosol浓度为1mg/ml。放入2℃~8℃冰箱备用。

精密天平称取Con A 20mg，加入5ml无菌生理盐水稀释，并用注射器吹打，直至Con A完全溶解。得到Con A浓度为4mg/ml。放入2℃~8℃冰箱备用。

1.2.2实验分组及Con A诱导肝损伤模型制作

将小鼠随机分为4组：A组为生理盐水对照组(NS组)，尾静脉注射生理盐水100μl预处理，6h后通过尾静脉注射100μl生理盐水；B组为鼠尾草酚对照组(Carnosol组)，尾静脉注射Carnosol (1mg/ml, 100μl)预处理，6h后通过尾静脉注射生理盐水100μl；C组为ConA对照组(ConA组)，尾静脉注射生理盐水100μl预处理，6h后通过尾静脉注射ConA（4mg/ml,100μl)；D组为鼠尾草酚保护组(Carnosol/ConA组)，尾静脉注射Carnosol (1mg/ml,100μl)预处理，6h后通过尾静脉注射ConA(4mg/ml,100μl)。

1.2.3血浆转氨酶的测定

各组小鼠预处理后18h，断颈处死小鼠，心脏穿刺抽血，迅速转移到EDTA-K2抗凝管中，置离心机中离心，全自动生化分析仪检测谷草转氨酶（AST），谷丙转氨酶(ALT)的水平。

1.2.4肝脏组织病理切片分析

处死小鼠，获取肝脏组织，HE染色，镜检观察各组小鼠肝组织坏死程度。由病理科两位主治医生进行双盲读片，评分。评分标准：0分：无坏死；1分：个别细胞坏死；2分：小于30%的坏死；3分：30~60%坏死；4分：大于60%的坏死^[1]。

1.2.5肝脏、外周血CD4⁺淋巴细胞计数检测

处死小鼠，心脏穿刺取血，转移到标记好的EDTA-K2抗凝血无菌管中备用，将肝脏、脾脏取出，制备成匀浆液备用，分别加入流式细胞仪专用的falcon试管进行编号，各管中加入CD4-APC、CD8-PE流式抗体试剂免疫荧光染色，再加入FACS溶血素溶解红细胞，洗涤去除细胞碎片及未结合抗体，流式细胞仪检测外周血、脾脏及肝脏组织CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞计数。

1.2.6外周血细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6水平的测定

处死小鼠，心脏穿刺抽血，抽取完毕后，迅速转移到抗凝管中，酶联免疫吸附试验法测定血浆TNF-α、IFN-γ、IL-6水平，获取肝脏组织后，制备匀浆液，实时荧光定量PCR法测定肝脏组织TNF-α、IFN-γ、IL-6、ICAM-1、NF-κB的mRNA表达水平。

1.2.7肝脏组织p65、IκBα磷酸化水平的测定

     处死小鼠，获取肝脏组织后，制备匀浆液，Westernblot法测定肝脏组织p65、IκBα磷酸化水平。

1.2.8统计学分析

所有数据均用Gradphad Prism 5.0以及SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料均以均数±标准差(mean±SD)表示。符合正态分布及方差齐性的数据采用单因素方差分析比较多组间的差异，多组之间任两组间比较采用Dunnett检验；不符合正态分布或方差齐性两者任一条件的数据采用Kruskal Wallis非参数检验统计方法比较多组间差异，组之间任两组间比较采用Dunnett检验。P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1鼠尾草酚Carnosol预处理对Con A诱导肝损伤小鼠外周血浆转氨酶的影响

自动生化仪检测后显示，各组小鼠经预处理后18h，ConA组小鼠血浆ALT、AST的水平明显高于其它三组（P均＜0.01），而Carnosol /ConA组小鼠血浆ALT、AST水平与NS组、Carnosol组比较，差异没有统计学意义(P均＞0.05)，见图1、图2。

图1 鼠尾草酚Carnosol预处理对ConA诱导肝损伤小鼠外周血ALT的影响

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group;^##p<0.01 vs ConA group.

图2 鼠尾草酚Carnosol预处理对ConA诱导肝损伤小鼠外周血AST的影响

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group；^## p<0.01vs ConA group.

2.2鼠尾草酚Carnosol预处理对ConA诱导肝损伤小鼠肝脏病理的影响

ConA组肝脏组织大面积坏死，肝细胞空泡样变性，重者胞浆成絮状改变，汇管区有大量淋巴细胞聚集；Carnosol /ConA组肝细胞水肿，可见小灶性坏死，但小叶结构可见，偶有不完整，汇管区可见少量炎症细胞浸润，见图3；Carnosol /ConA组小鼠肝脏损伤程度的评分明显低于Con A组(P<0.01)，见图4。

图3 鼠尾草酚预处Carnosol理对ConA诱导肝损伤小鼠肝脏病理的影响

HE染色，200×，图中箭头所指表示肝脏组织坏死区域

图4鼠尾草酚Carnosol预处理对ConA诱导肝损伤小鼠肝脏病理切片评分的影响

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group;^## p<0.01vs ConA group.

2.3肝脏、外周血CD4⁺淋巴细胞计数的变化

流式细胞仪检测结果显示，ConA组小鼠肝组织中CD4⁺T淋巴细胞计数显著高于NS组和Carnosol组(P<0.01)，而Carnosol /ConA组CD4⁺T淋巴细胞计数较ConA组明显降低(P<0.01)，各组间外周血CD4⁺淋巴细胞计数均无统计学差异(P均>0.05)，见图5、图6。

图5 各组小鼠肝脏CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞流式细胞计数典型图

图6 各组小鼠肝脏CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞计数

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group；^## p<0.01vs ConA group.

图7 各组小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞流式细胞计数典型图

图8 各组小鼠外周血CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞计数

ns：各组差异均无统计学差异，p>0.05

图9 各组小鼠脾脏CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞流式细胞计数典型图

图10各组小鼠脾脏CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞计数

ns：各组差异均无统计学意义，p>0.05

2.4血浆细胞因子水平的变化

各组小鼠预处理后18h，心脏取血，ELISA法检测各组小鼠血浆细胞因子

TNF-α、IFN-γ、IL-6的水平。结果显示，ConA组TNF-α、IFN-γ、IL-6的水平较NS组、Carnosol组显著升高(P均<0.01),而Carnosol/ConA组TNF-α、IFN-γ、IL-6的水平较ConA组明显降低(P<0.01)，见图11、图12、图13。

图11 各组小鼠外周血TNF-α水平变化 

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group;^## p<0.01vs ConA group.

图12 各组小鼠外周血IFN-γ水平变化

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group;^## p<0.01vs ConA group.

图13 各组小鼠外周血IL-6水平变化

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group;^# p<0.05vs ConA group,.

2.5肝脏组织TNF-α、IFN-γ、IL-6 mRNA的表达  

为了进一步明确肝内细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的水平变化，我们又检测了肝脏中TNF-α、IFN-γ、IL-6的mRNA表达水平。实时荧光定量PCR结果显示，ConA组肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、IL-6的mRNA的表达水平明显高于其它三组(P均<0.05)。而Carnosol/ConA组与NS组、Carnosol组三组之间肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、IL-6的mRNA的表达水平差异无统计学意义（P均>0.05）。肝脏组织中的TNF-α、IFN-γ、IL-6的mRNA的表达水平变化趋势与血浆中各因子的变化趋势一致，见图14、图15、图16。

图14 各组小鼠肝脏TNF-α mRNA表达

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group;^## p<0.01vs ConA group.

图15 各组小鼠肝脏IFN-γ mRNA表达

^** p<0.01 vs NS group, Carnosol group; ^# p<0.05 vs ConA group.

图16 各组小鼠肝脏IL-6 mRNA表达

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group; ^## p<0.01vs ConA group.

2.6 肝脏组织ICAM-1的表达

   实时荧光定量PCR测定结果显示，与ConA组相比，Carnosol/ConA组小鼠肝脏ICAM-1的mRNA的表达水平显著降低(P均<0.05)。而Carnosol/ConA组与NS组、Carnosol组肝脏ICAM-1的mRNA的表达水平无统计学差异(P均>0.05)，见图17、图18。

图17 各组小鼠肝脏ICAM-1 mRNA的表达

^** p<0.01vs NS group, Carnosol group;^## p<0.01vs ConA group.

2.7 各组肝脏组织NF-κB mRNA的表达水平

   我们检测了肝脏NF-κB的mRNA的表达水平。结果表明，与ConA组相比， Carnosol /ConA组肝脏NF-κB的mRNA的表达水平显著降低(P<0.01)。而NS组、Carnosol组、Carnosol /ConA组之间的肝内NF-κB mRNA的表达水平的差异无统计学意义(P均>0.05) ，见图19。

图19各组小鼠肝脏NF-κB mRNA的表达

^* p<0.05vs NS group, Carnosol group;^## p<0.01 vs ConA group.

2.8 肝脏组织p65、IκBα磷酸化水平

Westernblot法检测了肝脏组织p65、IκBα磷酸化水平。结果表明，与ConA组相比， Carnosol /ConA组肝脏组织p65、IκBα磷酸化水平显著降低，见图20。

图20各组小鼠肝脏p65、IκBα磷酸化水平

3.讨论

病毒性、免疫性、药物性肝炎是危害人类肝脏健康的三大因素，目前人类还没有报道已找到有效的方法来治疗肝炎或阻止肝炎的病理发展。在免疫性肝损伤的治疗药物研究中，为了更好的明确药物是否对疾病的发展和转归有保护作用，需要构建动物免疫性肝损伤模型。目前最常见最稳定的与自身免疫性肝损伤病理过程最相似的模型是ConA诱导小鼠肝损伤模型。基于此，本实验使用了C57BL小鼠构建ConA诱导的肝损伤模型来模拟免疫性肝损伤的病理过程。

在目前的研究中普遍应用肝功能及肝组织病理切片是评估肝损伤程度，本实验选择了能反应肝脏损伤具有代表性的两个指标谷丙转氨酶（ALT）及谷草转氨酶（AST）^[5-6]。研究表明，1%的肝脏细胞受到损害就能使血中的ALT的水平升高一倍^[7]，所以血中ALT水平通常被认为是显示肝损害或肝功能受损的重要指标。当肝细胞轻度损伤时，血中AST的升高程度低于ALT，只有当肝细胞受到严重损害时，血中AST才会升高。文献报道，ConA注射到小鼠体内10~12h后，血中ALT、AST达到峰值^[8-9]。本实验中各组小鼠经预处理后18h，检测血清AST、ALT水平，结果显示ConA组外周血ALT、AST显著高于carnosol /ConA组(P均<0.01)；而NS组、carnosol组及carnosol /ConA组之间的外周血ALT、AST的水平没有统计学差异(P均>0.05)。这表明鼠尾草酚carnosol对ConA诱导肝损伤具有很好的保护作用。小鼠肝脏组织做HE染色，病理切片显示，ConA组小鼠肝脏组织大面积坏死，肝细胞空泡样变性，重者胞浆成絮状改变，汇管区有大量淋巴细胞聚集；carnosol /ConA组肝脏坏死明显减轻。病理评分结果显示，carnosol /ConA组评分明显低于ConA组，差异具有统计学差异(P<0.05)。病理切片及评分结果进一步的说明了鼠尾草酚carnosol对ConA诱导肝损伤具有很好的保护作用。

免疫性肝损伤的实质主要是肝脏内相关免疫细胞的浸润(例如淋巴细胞)，免疫细胞被激活后释放炎症细胞因子对肝脏实质持续造成损伤。研究实验表明，免疫性肝损伤外周血及肝脏中都可以表现为TNF-α、IFN-γ、IL-6等细胞因子升高^[4-6]。大量的研究发现证实，TNF-α是导致ConA肝损伤最重要的细胞因子^[7-8]。TNF-α损伤肝组织的机理主要有以下几个方面：① 在转录终止水平以下诱导肝细胞的凋亡；② 损伤肝组织的微血管，导致弥漫性血管内凝血(DIC)，加重肝组织的损伤；③ 活化中性粒细胞，使其趋化，聚集于肝脏，促使中性粒细胞释放自由基，还可以激活细胞毒性T淋巴细胞的杀伤作用，使肝细胞受到损害。研究发现IFN-γ是导致ConA肝损伤的另外一个重要因子。IFN-γ主要由活化的T淋巴细胞及NK细胞产生，是重要的免疫反应的调控因子，具有激活T淋巴细胞增值、分化，促进NK细胞的杀伤活性等多种作用，Bozza等^[9]研究证实，对小鼠进行使用抗IFN-γ抗体预处理，发现ConA导致的肝损伤显著被抑制。IL-6是一种具有多种功能的细胞因子，能够活化T淋巴细胞，在自身免疫性肝病的患者外周血中IL-6的水平显著升高，研究显示减少IL-6的释放能够减轻ConA导致的肝损伤。大量的研究表明，ConA诱导肝损伤主要是以T淋巴细胞激活为主，激活后释放大量的细胞因子，特别是TNF-α、IFN-γ、IL-6对肝脏造成损伤。从实验中，我们发现各组小鼠预处理后18h后，ConA组小鼠肝内及外周血TNF-α、IFN-γ、IL-6水平较NS组及carnosol组明显升高，这个结果不仅说明ConA诱导肝损伤能够很好的复制人类免疫性肝损伤的病理过程，还说明肝内的细胞因子平衡失调是导致肝脏损伤的重要因素。此外，我们从实验中还发现，carnosol/ConA组的TNF-α、IFN-γ、IL-6的水平较ConA组明显降低，这说明鼠尾草酚carnosol具有很好的下调肝内炎性细胞因子的水平，使肝内的细胞因子的水平达到平衡的功能。

淋巴细胞是参与免疫反应的重要的细胞， T淋巴细胞的活化与ConA诱导的肝损伤有密切关系，Kazuyoshi等^[11]证实抑制T细胞的激活可以明显的抑制爆发性肝损伤的病理进程。为了进一步的探究分泌这些细胞因子的淋巴细胞的分类，我们选取了小鼠肝脏、外周血及脾脏CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞进行流式分析。从淋巴细胞浸润角度来看，实验表明，ConA诱导肝损伤是以CD4+T细胞为主。根据流式细胞仪的结果显示，carnosol/ConA组肝脏组织CD4⁺T淋巴细胞的计数较ConA组明显降低(P<0.05)，提示鼠尾草酚carnosol能够明显抑制CD4⁺T淋巴细胞对肝脏组织的浸润，从而减少其释放的细胞因子对肝脏的损伤。我们还观察到各组小鼠的外周血及脾脏组织之间的CD4⁺T淋巴细胞的计数没有统计学差异(P>0.05)，这可能与肝组织是ConA特异性靶器官有关^[10]。各组之间CD8⁺T淋巴细胞计数都没有统计学差异。由此，我们可以认为鼠尾草酚carnosol降低促炎因子的水平主要原因可能是通过减少CD4⁺T淋巴细胞的浸润来实现的。

肝脏持续性炎症主要是由于激活了淋巴细胞的归巢现象，在淋巴细胞的归巢的过程中，粘附因子起了重要的调控作用，其中ICAM-1尤为重要^[12-16]。正常的肝脏的肝细胞表面通常无ICAM-1表达，当肝脏炎症时，炎性局部的ICAM-1的表达与炎性细胞的浸润程度密切相关。因此，本实验选取具有重要作用ICAM-1为代表，了解其在ConA诱导肝损伤模型中的变化，从而推断鼠尾草酚carnosol保护ConA诱导肝损伤的免疫调节机制的作用点在于调控淋巴细胞的归巢现象，从而减轻炎症。本实验实时荧光定量PCR结果显示，在各组小鼠经预处理18h后，ConA组较carnosol/ConA组表达明显升高(P<0.05)，而carnosol/ConA与NS组、Rg1组比较， ICAM-1的表达没有统计学差异(P>0.05)。由此，我们推断鼠尾草酚carnosol通过减少粘附因子的表达水平来调控淋巴细胞的归巢，从而减轻对肝脏的损伤，起到保护肝脏的作用。

    为了更深入的探究鼠尾草酚carnosol影响细胞因子、粘附因子的上游机制，在本实验中我们检测了与免疫型肝损伤有密切关系的NF-κB^[20,21]。NF-κB是一种广泛存在于真核细胞的转录因子。其在肝脏中高度表达，对下游的基因进行调控，积极的参与肝脏疾病的发生与发展。据已有的文献报道，NF-κB是控制早期基因的表达的开关，是炎症反应免疫调节的上游环节，特别是对前炎症因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、细胞粘附因子等进行调控，在机体的各种免疫反应中发挥中重要的作用^[22-25]，NF-κB能够被炎性细胞因子激活，而后它反过来又诱导炎性因子的表达增强，这样的形成一个正反馈调节，因此，NF-κB通常被称为人体免疫反应的中心“调解员”。Imose^[26]的研究表明，能够通过抑制肝内NF-κB的活性降低肝脏炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ的水平，从而达到减轻肝脏的炎症损伤的目的。在本实验的结果显示，在各组小鼠经预处理18h后，ConA组的肝内NF-κB的表达明显高于其它三组(P<0.05)；carnosol/ConA组、NS组及carnosol组之间肝内NF-κB的表达差异没有统计学意义(P>0.05)。Western blot法检测了肝内p-p65、p-IκBα的蛋白含量，结果显示，与ConA组相比，carnosol /ConA组肝内p-p65、p-IκBα的蛋白含量显著降低。据我们的实验结果及既往的研究，我们有理由推测，鼠尾草酚carnosol抑制NF-κB的活性进而影响到TNF-α、IL-6、IFN-γ、及ICAM-1的分泌，阻断NF-κB与炎症介质之间的正反馈，起到保护肝脏的作用。

综上所述，推断鼠尾草酚carnosol保护ConA诱导肝损伤机制主要有：鼠尾草酚carnosol通过下调肝脏NF-κB的表达，进一步抑制炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的分泌，从而减轻肝脏组织的炎症；鼠尾草酚carnosol减少CD4⁺T淋巴细胞在肝脏组织的浸润，可能与其抑制粘附因子ICAM-1表达密切相关。

参考文献