浙江纺织服装职业技术学院学报稿件信息
新疆昭苏县马梨形虫病病原及抗体检测
樊新丽1， 张梦圆1 ，马玉辉2，张伟1， 吾力江·卡马力1，李海2，宋晶晶1， 李敏1， 肖培培1， 马钰1，巴音查汗1*
（1.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2. 昭苏县畜牧兽医站，昭苏 835604）
摘 要：马梨形虫病是由驽巴贝斯虫和马泰勒虫寄生于马属动物的红细胞内所引起的一类血液原虫病，呈全球性分布，尤其在新疆发病率更高，处于逐年上升趋势，对区域性马产业的发展影响极大。为了解2018年昭苏县养马区域对此病的感染情况，本实验随机采集昭苏县18个乡镇的马全血及血清各858份，采用PCR和间接ELISA方法分别对马全血及血清进行检测，并将PCR产物进行测序鉴定，对用两种方法检测的18个地区、不同年龄阶段的马驽巴贝斯虫、马泰勒虫及两者混合感染的数据进行统计学分析。结果显示，PCR检测马驽巴贝斯虫、马泰勒虫及两者混合感染的阳性率分别为12.12%、13.87%、2.80%；ELISA检测马驽巴贝斯虫、马泰勒虫及两者混合感染的抗体阳性率分别为15.50%、10.14%、2.56%；不同年龄阶段的马梨形虫病的筛查结果显示，在6岁以下的马匹感染马驽巴贝斯虫、马泰勒虫及二者混合感染的阳性率较高，并且不同地区的不同年龄阶段的马匹感染马梨形虫病存在不同程度的差异。此次获得的昭苏县马梨形虫病的一线数据可为当地养马区域马梨形虫病的综合防控提供技术支撑。
关键词：昭苏马；马梨形虫病；病原；抗体；检测
*Corresponding author
基金项目：2016年国家自然基金（项目编号：31660711）；新疆农业大学校前期项目（XJAU201702）
作者简介：樊新丽（1993-），女，甘肃张掖人，硕士研究生，主要从事预防兽医学研究
Detection of pathogen and antibody of Equine piroplasmosis in Zhaosu area of XingJiang
FAN Xin-li1, ZHANG Meng-yuan1, MA Yu-hui2 , ZHANG Wei1,WU Li-jiang1, LI Hai2, SONG Jing-jing1, LI Min1, XIAO Pei-pei1, MA Yu1, BAYincha-han1* (1.College of Animal Medicine Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2.Zhaosu Veterinary Station, Zhaosu, Xinjiang 835604, China)
Abstract: Equine piroplasmosis is a kind of hematogenous pathogen caused by Babesia caballi and Theileria equi in the red blood cells of Equine. It is globally distributed, especially in Xinjiang. The upward trend has a great impact on the development of the regional horse industry. In order to understand the infection of this disease in the horses area of Zhaosu County in 2018, this experiment randomly collected 858 horse blood and serum from 18 townships in Zhaosu County, using PCR and indirect ELISA to separate horse blood and serum. The detection was carried out, and the PCR products were sequenced and identified. The data of the mixed infections of Babesia caballi, Theileria equi and the two of the 18 regions and different ages detected by the two methods were statistically analyzed. The results showed that the positive rates of PCR detection of Babesia caballi, Theileria equi and their mixed infection were 12.12%, 13.87%, 2.80%, respectively; ELISA detected Babesia caball, Theileria equi and their mixed infections. The antibody positive rates were 15.50%, 10.14%, and 2.56%, respectively. Screening results for Equine piroplasmosis at different ages showed that horses under 6 years of age were infected with Babesia caballi, Theileria equi, and mixed infections. The positive rate is higher, and there are different degrees of differences in horse-infected horses at different ages in different regions. The first-line data of the Equine piroplasmosis in Zhaosu County obtained this time can provide technical support for the comprehensive prevention and control of Equine piroplasmosis in the local horse-raising area.
Key words: Zhaosuma; Equine piroplasmosis; Pathogen; Antibody; Detection
马梨形虫病（Equine piroplasmosis，EP）是由马驽巴贝斯虫（Babesia caballi）和马泰勒虫（Theileria equi）寄生于马属动物（马、驴、斑马、骆驼等）红细胞内所引起的一类蜱传性血液原虫病[1-2]。马驽巴贝斯虫的生活史以宿主的红细胞为唯一的靶细胞，而马泰勒虫进入宿主体内的感染性孢子体首先侵犯外周血单核细胞，随后迁移至红细胞内发育为裂殖子。发生马梨形虫急性病例常出现发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿等特征性症状，从而降低马属动物的生产性能，若不及时治疗则死亡率较高[3-4]；慢性病例马匹症状时常表现为非特异性的炎症反应，但大部分感染梨形虫的马匹都呈隐性感染经过，马匹感染梨形虫但不表现出任何明显的临床症状，因此隐性感染的马匹是梨形虫传播扩散的潜在传染源[5-6]。昭苏县是新疆地区主要养殖马基地，由于当地马匹数量较多、草场面积大、草地植被硬蜱广泛孳生等原因[7-8]致使马梨形虫病频发，故马梨形虫病的发生具有一定地区和季节流行性[9-10]，主要流行于春季（2-6月份），该病发生对当地养马业的健康发展影响极大[11-12]。目前，本病尚未有有效的疫苗和特效药物，检测、监控及采取针对性综合防治是目前普遍应用的防控措施。本研究为了解马梨形虫病在新疆昭苏县的流行情况，采用PCR[13]及间接ELISA方法[14-15]，分别对昭苏县18个实验点进行马梨形虫病病原及抗体的检测和筛查，获得了当地养马区域有关感染马梨形虫病的一线流行病学数据，旨在为当地制定有效的马梨形虫病综合防控策略及其蜱媒病的防控计划奠定基础。
1 材料与方法
1.1 样品来源 2018年5月-6月，对昭苏县18个乡镇的马匹进行了抽样调查，分别采集昭苏种马场农牧民散养（A）51份、昭苏军马场山地草场（B）51份、昭苏县昭苏马场（C）73份、昭苏咸喀拉苏（D）47份、喀拉苏繁育中心（E）60份、昭苏县察汗乌苏配种站（F）65份、察汗乌苏乡蒙古拜尔（G）20份、昭苏县乌察布拉克（H）24份、伊宁昭苏县昭苏镇（I）37份、伊宁昭苏洪纳海配种站（J）38份、伊宁昭苏县咯夏加尔镇（K）39份、伊宁昭苏镇种马场（L）121份、昭苏镇农牧民（M）51份、昭苏县阿克孟拉镇（N）27份、昭苏镇萨尔阔布乡配种站（O）75份、昭苏县扛场（P）30份、昭苏天山乡配种站（Q）20份、昭苏县夏特乡（R）29份等18个乡镇的马全血及血清，进行马梨形虫病感染情况检测。马血样：按常规方法经颈静脉采集、带回实验室4℃保存待用，共858份；血清样品：由颈静脉采血，摆成斜面，置4℃冰箱5h，待血清析出后收集血清，-20℃保存待检，共858份。
1.2 主要试剂 全血DNA提取试剂盒和兔抗马IgG购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Taq DNA聚合酶、MgCl、dNTPs、DL2000 Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，TMB显色液购自北京索莱宝科技有限公司，ELISA酶标板购自NUNC公司。
1.3 马梨形虫的PCR检测 严格按照组织全血DNA提取试剂盒说明书对858份马全血进行核酸提取。后进行PCR检测，方法及引物马泰勒TE18s-F/R和驽巴贝斯虫BC48-F/R参照宋瑞其提供的方法[13]，两对引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。反应体系(25 µL)：2 xTaq PCR Green Mix12.5 L，上、下游引物（10μmol L）各1.0μL，模板DNA2.0 µL，灭菌双蒸水补充至25μL。马泰勒虫与马驽巴贝斯虫反应条件分别为：30s/94℃、30s/55℃、45s/72℃、35cycles和30s/94℃、30s/56℃、45s/72℃、35cycles；扩增产物取5μL上样，进行琼脂糖凝胶电泳检查结果。查看琼脂糖凝胶电泳结果后，将疑似马驽巴贝斯虫及马泰勒虫阳性PCR产物送至昆泰锐测序公司进行测序。
表一 引物序列及目的片段长度
Table 1 Primer sequence and length of the target fragment
|
靶生物体 Target organism |
引物 Primer |
序列（5´→3´） sequence（5´→3´） |
片段大小/bp Fragment size/bp |
|
T.Equi |
TE18s-F |
TTTGGGCTGTTTACAGTTGC |
512 |
|
TE18s-R |
CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG |
||
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B.caballi |
BC48-F |
GCGACGTGACTAAGACCTTATTGG |
452 |
|
BC48-R |
GTTCTCAATGTCAGTAGCATCCGC |
1.4 马梨形虫的ELISA检测 严格按照本实验室已建立的马驽巴贝斯虫间接ELISA方法[14]以及马泰勒虫间接ELISA方法[15]。用PBS缓冲液将纯化后的马驽巴贝斯虫和马泰勒虫目的蛋白稀释为最适工作浓度（2 μg/mL），采用碳酸盐ELISA包被缓冲液稀释的马驽巴贝斯虫重组蛋白His-Bc48和马泰勒虫重组蛋白GST-EMA1包被酶标板，按照每孔100 μL加入至反应板中，4 ℃孵育过夜。每孔加入200 μL PBST（0.5%吐温）清洗3次，甩掉液体后每孔加入200 μL 5%脱脂乳，37 ℃封闭1 h。然后将封闭好的反应板洗涤3次。待检血清用封闭液100倍稀释，每个样品重复3个反应孔，每孔100 μL，37 ℃下孵育1 h，同时设阴性、阳性标准血清和空白孔各2个孔作为对照。将反应板洗涤3次甩净液体后，加入10 000倍稀释后的辣根过氧化酶标兔抗马，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。再次将反应板洗涤3次后，每孔加入显色液100 μL，37 ℃下作用15 min后，每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4 进行终止。最后在ELISA平板读数器（酶标仪）中在450 nm处读数。
1.5 ELISA判定标准的测定 计算检测样品OD450nm 的
