黄芪甲苷对H₂O₂损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用

张荔¹，孙付军²

（1、襄阳市中医医院 湖北 襄阳 441000 2、山东省中医药研究院 山东 济南 250014）

摘要：目的 观察黄芪甲苷（AS-IV）对H₂O₂损伤的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的SOD酶活性，LDH释放量的影响，单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和细胞粘附分子-1（ICAM-1）的表达，探讨黄芪甲苷对H₂O₂损伤的人脐静脉内皮细胞的保护作用及其对心血管的保护作用。方法：H₂O₂体外诱导HUVECs，加入不同浓度的黄芪甲苷，MTT法测定细胞活力，试剂盒测SOD酶活性和LDH释放量，荧光实时定量PCR（RT-PCR）检测不同黄芪甲苷浓度下内皮细胞MCP-1和ICAM-1 mRNA的表达。结果：12.5μg/ml～50μg/ml的黄芪甲苷能显著提高H₂O₂损伤细胞活力和SOD活性，减少LDH释放，明显降低H₂O₂组MCP-1和ICAM-1 mRNA的表达。结论：黄芪甲苷保护H₂O₂损伤的血管内皮细胞，改善动脉粥样硬化等血管疾病的进程。

   关键词：黄芪甲苷；HUVECs；H₂O₂；动脉粥样硬化；MCP-1；ICAM-1

   近年来，心脑血管疾病的发病率和死亡率逐年升高，严重危害人类的健康，全世界每年约有1700万死于心脑血管疾病。^［1］大量研究表明动脉粥样硬化、血栓、高血压及心衰等心血管疾病都伴有血管内皮细胞损伤。^［2］氧化应激是一种由体内活性分子如氧自由基的产生和清除失调造成体内活性氧（ROS）生成和抗氧化防御之间的平衡紊乱的细胞应激反应，是多种心脑血管疾病内皮细胞损伤的重要机制。^［3］大量ROS能增加细胞黏附分子如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达。研究表明，黄芪甲苷可减少心肌细胞损伤和阻止内皮细胞功能障碍。^［4］因此本实验用黄芪甲苷作用于H₂O₂损伤的人脐静脉内皮细胞，观察受损细胞的超氧化物歧化酶（SOD）和上清液乳酸脱氢酶（LDH）的含量，MCP-1和ICAM-1的mRNA的表达，探讨黄芪甲苷在动脉粥样硬化细胞粘附过程中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 黄芪甲苷粉剂购于南京春秋生物有限公司；人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）购于上海博古生物有限公司；胎牛血清、MTT购于Sigma公司；RPMI-1640培养基购于GIBCO公司；SOD、LDH 试剂盒和BCA法总蛋白含量测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；胰蛋白酶购于HyClone公司；三氯甲烷购于Amresco公司；逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购于Inritrogen；引物由Inritrogen公司合成；Western及IP细胞裂解液购于碧云天生物有限公司。

1.2 仪器 超净工作台，ESCO公司产品；二氧化碳培养箱，日本三洋公司；低温高速离心机，美国BECKMAN公司；倒置显微镜，Olympus公司；荧光实时定量PCR，Bio-Rad公司；酶标仪，BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及分组 HUVECs于CO₂恒温培养箱中培养，长成70%-80%融合状态时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，37℃恒温培养箱中孵育2-3min显微镜观察细胞收缩变圆时弃去胰酶，培养液终止消化，巴氏滴管吸取培养液吹打瓶壁成细胞悬液，将细胞悬液接种于新的细胞瓶中传代，继续培养，以后根据细胞数量每2～3d传代一次。将HUVECs细胞分为5组，正常组细胞只加普通培养基，H₂O₂组（模型组）加300μmol/L，低剂量黄芪甲苷组（H₂O₂+12.5μg/ml黄芪甲苷），中剂量黄芪甲苷组（H₂O₂+25μg/ml黄芪甲苷）；高剂量黄芪甲苷组（H₂O₂+50μg/ml黄芪甲苷）。

1.3.2 MTT法测黄芪甲苷对H₂O₂损伤的HUVECs的影响 生长良好的细胞制成细胞悬液，5×10³个/孔密度铺设于96孔板中。5个组，每组设5个平行，24h后每孔加入的MTT溶液（浓度为5μg/mL）10μL，37℃孵育4 h，弃去上清液，加入100μL二甲基亚砜，震荡10min，酶标仪490nm 波长测定每孔的吸收值，重复3次求出各组细胞的存活率。

1.3.3  LDH和SOD含量测定 调整细胞浓度1×10⁵个/孔接种于6孔板中，按细胞分组的5组接种后在CO₂培养箱中培养24h后按照LDH试剂盒说明书测定上清液中LDH含量。弃去培养液，用PBS洗2次，加入100μl细胞裂解液，裂解完全后按照BCA试剂盒方法测定细胞总蛋白含量，并按试剂盒说明书测定SOD活力。

1.3.4  RT-PCR检测HUVECs中MCP-1，ICAM-1的表达 收集上诉实验组的HUVECs细胞，依照RT-PCR试剂盒说明书操作，Trizol试剂提取各组总RNA，溶于DEPC水中，冷冻保存。用逆转录试剂盒合成cDNA，取逆转录产物10μL进行PCR扩增，扩增条件为：首次循环95℃变性2min，分别为94℃20s，58℃30s，72℃20s，共40个循环。引物序列：ICAM-1,上游：5′-CTC CAA TGT GCC AGG CTT G-3′下游：5′-CAG TGG GAA AGT GCC ATC CT-3′（71bp）;human MCP-1,上游： 5′-CAT TGT GGC CAA GGA GAT CTG-3′下游：5′-CTT CGG AGT TTG GGT TTG CTT-3′（91bp）;humanβ-actin，上游：5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′下游：5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′（116bp）。^［5］

2 结果

2.1 不同浓度的黄芪甲苷对H₂0₂损伤模型的影响

不同浓度的黄芪甲苷能不同程度的改善H₂0₂对HUVECs细胞的损伤，分为正常细胞组，300μmol/LH₂0₂模型组，低剂量黄芪组（12.5μg/ml+300μmol/LH₂0₂），中剂量剂量黄芪组（25μg/ml+300μmol/LH₂0₂，高剂量黄芪组（50μg/ml+300μmol/LH₂0₂），高剂量和中剂量影响尤为突出。

图1  黄芪甲苷对H₂0₂诱导HUVECs细胞活力的影响（±s，n=3）与模型组相比“*”P<0.05，“**”P<0.01，下同

2.2 黄芪甲苷对H₂0₂诱导HUVECs氧化指标的影响

与模型组相比，黄芪甲苷给药组SOD能显著升高，LDH明显降低。

图2  黄芪甲苷对H₂0₂诱导HUVECs细胞SOD和LDH的影响（±s，n=3）与模型组相比“*”P<0.05，“**”P<0.01，下同。

2.3 黄芪甲苷对H₂0₂诱导HUVECs细胞ICAM-1表达的影响 RT-PCR测各组细胞的ICAM-1表达量，结果显示H₂0₂模型组能升高ICAM-1的表达，不同浓度的黄芪甲苷均能不同程度的降低ICAM-1的表达

图3 黄芪甲苷对H₂0₂诱导HUVECs细胞ICAM-1表达的影响（±s，n=3）与模型组相比“*”P<0.05，“**”P<0.01，下同。

2.4 黄芪甲苷对H₂0₂诱导HUVECs细胞MCP-1表达的影响 RT-PCR测各组细胞的MCP-1表达量，结果显示H₂0₂模型组能升高MCP-1的表达，不同浓度的黄芪甲苷均能不同程度的降低MCP-1的表达

图4 黄芪甲苷对H₂0₂诱导HUVECs细胞MCP-1表达的影响（±s，n=3）与模型组相比“*”P<0.05，“**”P<0.01

3 讨论

本实验通过H₂0₂诱导HUVECs细胞造成氧化损伤模型，探讨黄芪甲苷对内皮细胞的保护作用。H₂0₂可以穿透细胞膜进入细胞，造成膜脂质过氧化，造成内皮细胞损伤和功能紊乱。黄芪甲苷促进人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)上调，通过刺激VEGF的表达而促进血管新生。^［6］单核细胞趋化蛋白(MCP-1)作为趋化因子家族蛋白，通过对下游单核细胞或巨噬细胞激活作用，促进炎性细胞对血管内皮造成损伤。^［7］细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是免疫球蛋白超家族的成员之一，动脉粥样硬化中内皮细胞表达的重要粘附分子，在动脉硬化早期单核细胞粘附于血管壁及细胞增殖与迁移、泡沫细胞形成中发挥重要作用。^［8］在细胞受损时，LDH 就会从细胞的胞浆中释放出来，因此常将LDH 的释放率作为细胞受损程度的敏感指标之一。SOD是一种胞内氧化酶，可以清除氧自由基。本实验氧化指标显示黄芪甲苷能使损伤细胞内SOD酶增多，LDH释放量降低，显示黄芪甲苷能增强细胞的抗氧化能力，抵抗氧化应激损伤，保护内皮细胞。黄芪甲苷能降低损伤模型组MCP-1和ICAM-1的表达，通过抑制单核细胞与内皮细胞的粘附和迁移，保护动脉粥样硬化中受损的内皮细胞。

本研究表明，黄芪甲苷能有效抑制H₂0₂对HUVECs细胞造成的氧化损伤，保护内皮细胞，对预防和治疗动脉粥样硬化有积极的作用。

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