热处理对番茄黄酮多酚含量及抗氧化活性的影响

陈子涵 ,蒋继宏, 鞠秀云, 刘金娟

（江苏师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221116）

摘要 本文测定热处理对番茄中的多酚、黄酮类物质含量及其体外抗氧化活性的影响。以 DPPH·、O₂^-·、·OH、NO₂^-、总抗氧化能力、总还原力以及对人肝细胞株LO2氧化损伤的保护作用等抗氧化指标来评价热处理对番茄提取物抗氧化能力的影响。结果表明番茄提取物具有一定的抗氧化活性，热处理会显著增加番茄抗氧化活性，热处理后番茄提取物中酚类和总黄酮含量明显升高，分别比原来增加了3.02 mg/L和10.78 mg/L；对DPPH·、O₂^-·、·OH、NO₂^-的清除作用也明显增强，并且呈现出一定的浓度依赖性；同时总抗氧化能力、还原能力以及对人肝细胞株LO2氧化损伤的保护能力都明显增加。综合比较发现热处理明显增强了番茄提取物的抗氧化能力，也是释放番茄中多酚黄酮类活性成分的一种有效加工方式。

关键词：番茄；热处理；抗氧化活性；总酚；总黄酮

 [中图分类号]     [文献标识码] A       [文章编号] 

Effect of heat treatment on the total phenols and flavonoid content and antioxidant activity of tomatoes

  Chen Zihan  Jiang Jihong  Ju Xiuyun  Liu Jinjuan *

（Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plants of Jiangsu Province, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116）

Abstract To investigate the effect of heat treatment on the contents of total phenols flavonoids and the antioxidant activity of tomatoes extraction. The effects of DPPH·, O₂^-·, ·OH, NO₂^-, total antioxidant capacity, total reducing power and protective effect on the oxidative damage of human liver cell line LO2 were evaluated to evaluate the effect of heat treatment on antioxidant capacity of tomato extrac. The results showed that tomato extraction have some antioxidant activity and heat treatment could significantly enhance the antioxidant capability. Meanwhile, the contents of total phenols, total flavonoids were increased after heat treatment (3.02 mg/L and 10.78 mg/L, respectively). The scavenging activities of DPPH radical, O₂^-·radical, ·OH radical, NO₂^- radical were increased significantly in a dose dependent manner. The total antioxidant capacity, reducing power and the ability to protect human liver cell line LO2 from oxidative damage were significantly increased. Comprehensive comparison found that heat treatment significantly enhanced the antioxidant capacity of tomato extract, and was also an effective way to release the active ingredients of polyphenols and flavonoids in tomato.

Key words：tomato; heat treatment; antioxidant activity; total phenol; total flavonoids

番茄（Solanum lycopersicum）又名西红柿，为茄科茄属草本植物，原产于中美洲和南美洲，现作为食用蔬果已被全球性广泛种植。番茄不仅含有丰富的营养^[1]，而且含有大量番茄红素、黄酮、多酚以及谷胱甘肽、类胡萝卜素等多种抗氧化、抗衰老物质^[2,3]。很早以前就有科学研究证实，番茄中的番茄红素是一种功能性天然色素，具有独特的抗氧化能力，可以清除人体内导致衰老和疾病的自由基，其淬灭单线态氧的速率常数远高于维生素E ^[4]。番茄红素不仅具有很好的抗氧化能力，还能有效的防治各种疾病。Yang等研究发现，番茄红素具有阻止前列腺癌变，抑制前列腺癌细胞生长的作用^[5]。番茄中还含有一类重要的次级代谢多酚产物-类黄酮，它是一种很强的抗氧剂。Beate等对类黄酮的研究已证实，类黄酮通过氧自由基和酚羟基反应生成较稳定的半醌式自由基，从而终止自由基链式反应，最终有效的减少和清除了体内的氧自由基和羟基自由基^[6]。

有研究表明热处理可有效改变提取物的抗氧化活性。目前对于番茄抗氧化作用虽有一些研究，但是关于在番茄加工过程中热处理对抗氧化能力的影响鲜见报道。因此，本文主要研究了热处理对番茄提取物中二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）、羟自由基（·OH）、超氧阴离子（O₂^-·）和亚硝酸盐（NO₂^-）的清除能力、总抗氧化力及总还原能力的影响，同时检测了热处理前后总酚、总黄酮的含量变化，并初步在细胞水平上研究了热处理对番茄抗氧化能力的影响。为进一步深入开发利用具有天然抗氧化的番茄资源提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番茄，市购，将番茄清洗干净，备用。

没食子酸对照品（纯度高于98%）上海生物工程技术有限公司 ；邻菲罗啉（分析纯）  北京欣经科试剂公司；DPPH·自由基  美国Sigma 公司；总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒  南京建成生物工程研究所产品；无水乙醇、浓盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、亚硝酸钠、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、30%H₂O₂、无水碳酸钠、碳酸氢钠、硫脲、三水合乙酸钠、CuSO₄·5H₂O均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

5804R 型高速冷冻离心机  德国Eppendorf Centrifuge公司；UV-1700 SPC型紫外可见分光光度计  日本SHIMADZU；AL204电子天平  梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-S4A型恒温水浴锅  北京科伟永兴仪器有限公司；超纯水系统  Millipore公司等。

1.3 方法

1.3.1样品溶液的制备  取番茄2个，其中一个沸水浴处理3 min后，分别用家用榨汁机榨汁获得汁液，4000 r/min 4℃离心15 min，取出上清液，0.22 μm无菌滤膜抽滤后，-20 ℃保存备用。

1.3.2总酚含量测定  采用Folin-Ciocalteu法^[7]。以没食子酸为标准品，得标准曲线方程为：y=0.0009x+0.0046，R²=0.9985。样品测定方法：准确吸取待测样液1.0 mL于25 mL棕色容量瓶，加入 FC 试剂1.0 mL，充分混匀后加入7%碳酸钠溶液10 mL，用蒸馏水定容至刻线，30 ℃避光放置1 h，于766 nm 测定吸光度值。平均测定3 次，取平均值。根据标准曲线计算多酚类化合物的没食子酸当量(GAE)，计算公式如下：GAE=(Y×25×n)/(m×1000)式中：Y为根据标准曲线算得样品浓度值(mg/mL)；n为提取液稀释倍数；m为果皮称样量（g）。

1.3.3总黄酮含量测定  取1 ml 样品提取液精确的度量之后，倒入10 ml 的容量瓶中，然后向其中倒入5% 的亚硝酸钠溶液0.3 ml，充分混合均匀之后在常温下放置5 min。然后再向其中加入10% 的硝酸铝溶液0.3 ml，充分混合之后在常温下放置5 min。然后加4%的氢氧化钠溶液4 ml。分别用蒸馏水滴定到刻度，常温下放置15-20 min，最后在波长510 nm下测定吸光值，重复3 次。以蒸馏水作为空白，芦丁做标准曲线，建立的回归方程为：y=0.0026x-0.0177，R²=0.9961,，式中y为吸光度值，x为芦丁浓度(μg/mL)。计算黄酮含量。

1.3.4 羟自由基（·OH）清除能力测定  采用邻二氮菲-Fe²⁺氧化法^[8]。向反应管中依次加入5 mmol/L邻二氮菲溶液1.0 mL，PBS缓冲液（pH 7.4）3.8 mL和待测样液1.0 mL，充分混匀，加5 mmol/L硫酸亚铁1.5 mL，混匀，加0.1%的过氧化氢1.0 mL，加水稀释至10 mL，37 ℃保持30 min，536 nm下测定其吸光度，记作A样；同上操作，不加双氧水作为未损伤管，测吸光值记为A未损；不加样品液作为损伤管，测吸光度为A损。按下式计算对·OH清除率：

1.3.5亚硝酸盐（NO₂^-）清除率测定  盐酸萘乙二胺法^[9]。向反应管中依次加入 5 μg/ml 的亚硝酸钠3.0 ml，pH 3.0 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液5.0 ml 和待测样液2.0 ml，摇晃使各种试剂混合均匀之后保存于37 ℃的条件下15 min，结束后迅速加入0.4%对氨基苯磺酸2 ml，混合充分之后放置4 min，加入0.2%盐酸萘乙二胺1.0 ml，混匀，静置15 min，在538 nm 波长处测定吸光度。分别以相应浓度样液做空白试验。按下式计算清除率：

1.3.6超氧阴离子自由基（O₂^-·）清除率测定  采用邻苯三酚自氧化法^[10,11]。向试管中依次加入6.0 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液和1.0 mL待测样液 (空白管以1.0 mL蒸馏水代替)，混合均匀后于25 ℃水浴恒温25 min，加入1.0 mL 8 mmol/L的邻苯三酚溶液，迅速混匀，准确反应4 min后加入两滴浓HCl溶液终止反应，于325 nm下测定吸光度。按下式计算O₂^-·清除率：

1.3.7 二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除率测定  测定参照参考文献^[12-13]。本实验中准确称取40 mg DPPH，用无水乙醇溶解并定容于500 mL的容量瓶中，DPPH的浓度为0.2 mmol/L。采用DPPH法将番茄提取物用50%乙醇配成10、20、40、80 μL的受测液备用，每个体积设3个复孔，517 nm处测各孔的吸光度。100 μL DPPH溶液+100 μL受测液(A0)，100 μL DPPH溶液+100 μL50%乙醇溶液的吸光度(A1)，100 μL受测液+100 μL 50%乙醇溶液的吸光度(A2)。按下式计算DPPH自由基清除率。实验重复3次。

1.3.8总还原力测定  采用普鲁士蓝法^[14]。向反应管中依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.6)，2.5 mL 1%铁氰化钾溶液和1.0 mL待测样液，充分混匀后于50 ℃保温20 min，迅速冷却，加入2.5 mL10%三氯乙酸之后混匀，于5000 r/min转速下离心10 min，取上层液体2.5 mL，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL0.1%三氯化铁，混匀，在700 nm下测定吸光度，吸光度越大，还原力越强。以同浓度样品溶液代替样品做空白试验。

1.3.9 总抗氧化能力测定  按总抗氧化能力检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书进行操作。

1.3.10 Alamar blue法检测热处理后番茄提取物对正常LO2细胞的影响 将处于对数生长期的LO2细胞传代，将细胞接种于96孔板上，每孔加入100 μL细胞悬液，空白组中加入100 μL不含细胞的培养基，放入37℃，5% CO2恒温培养箱中培养过夜，使细胞完全贴壁生长。然后对照组加入100 μL DMEM培养基，实验组加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释的热处理前后番茄提取物， 24 h后Alamar blue法检测细胞的成活率，置于570 nm的激发波长和590 nm的发射波长下检测荧光值。公式如下：抑制率=【（空白对照荧光值-样品荧光值）/（空白对照荧光值-无细胞空白荧光值）】×100％

1.3.11 细胞氧化损伤模型的建立及番茄提取物的保护  将处于对数生长期的LO2细胞制成细胞悬液，向96孔细胞培养板中每孔加入100 μL细胞悬液，空白组中加入100 μL不含细胞的培养基，培养过夜。然后损伤模型组和实验组分别加入50 μL完全培养基稀释的H₂O₂使其终浓度达到800 μM，实验组加入50 μL完全培养基稀释的热处理前后番茄提取物。同时设立对照组和空白组，对照组不加H₂O₂，空白组不接种细胞也不加过氧化氢，但加入相同体积的培养基，每组设置三个复孔。培养24 h后Alamar Blue法检测，计算细胞成活率。

1.3.12 数据处理  试验所得数据采用SPSS统计软件进行单因子方差分析和线性回归分析，以`x ± s来表示。

2 结果与分析

2.1 热处理对番茄提取物中总多酚及总黄酮含量的影响

热处理前后番茄提取物中总酚和总黄酮含量差异显著（见表1）。热处理的番茄提取物中总酚含量为13.43±1.36 mg GA/L，与对照组（10.41±0.91 mg GA/L）相比明显升高（P<0.05）；热处理的番茄提取物中总黄酮含量为16.34 ±1.03 µg/L，与对照组（5.56±0.58 µg/L）相比也明显升高（P<0.01）。研究表明植物总多酚和总黄酮含量与其抗氧化能力包括自由基的清除之间具有一定的相关性^[15]。本研究中番茄提取物热处理后总酚和总黄酮含量明显升高，说明热处理可能会影响番茄提取物的抗氧化活性。

表1 不同处理组番茄提取物的总酚和总黄酮含量 (`x ± s, n=3)

Table 1 Polyphenols and Flavone content of in different treatment groups in the tomato extraction

*P<0.05，**P<0.01，以下同

2.2 热处理对番茄提取物清除·OH和亚硝酸盐（NO₂^-）能力的影响

羟基自由基（·OH）是危害最大的一种活性氧自由基，而亚硝酸盐（NO₂^-）也可导致癌症、氧化衰老等疾病的发生^[16]。本研究结果显示与对照组相比较，热处理后番茄提取物对·OH的清除能力明显增强（表2），并且随着提取物的稀释倍数增加，这种作用越明显；热处理后番茄提取液对NO₂^-的清除能力也明显增强，但随稀释倍数的增加，清除能力变化不大（表3）。说明热处理能够显著影响番茄提取物对·OH和NO₂^-的清除能力。

表 2 番茄提取物对·OH 的清除率 (%)

Table 2 Scavenging rates of tomato extraction on ·OH radicals

表 3 番茄提取物对 NO₂-的清除率 (%)

Table 3 Scavenging rates of tomato extraction on NO₂^- radicals

2.3 热处理对番茄提取物清除超氧阴离子自由基（O₂^-）能力的影响

O₂^-·自由基可引发生物膜多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化物反应，损伤膜的结构及功能，加快从皮肤到内部器官整个肌体的衰老过程，引发多种衰老疾病^[17]， 严重危害人体健康。本实验结果显示热处理后的番茄提取物对 O₂^-·的清除作用明显增强，呈现明显的浓度依赖性，且随稀释倍数的增加，差异越明显（表4）。

表 4 番茄提取物对 O₂^-·的清除率 (%)

Table 4 Scavenging rates of tomato extraction on O₂^-·radicals

2.4 热处理对番茄提取物清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）能力的影响

DPPH·是一种稳定的以氮为中心可提供一种稳定质子的自由基，当溶液中存在有供氢能力的抗氧化剂时 如酚类其可与DPPH·单电子配对，将溶液还原为浅黄色吸光度变小且其褪色程度与接受电子的数量呈正比。所以通过测定DPPH·自由基含量变化来评价抗氧化物质的抗氧化能力^[18,19]。检测结果显示随着番茄提取物量的加大，DPPH·自由基的清除能力也逐渐增加。热处理后提取物的DPPH·自由基的清除能力明显高于对照组，特别是加入10 μL提取物时，两者差异极显著（P<0.01）；但是随着加入量的增加，这种趋势逐渐缩小，说明番茄提取物都具有一定DPPH·自由基清除能力，热处理后能够提高DPPH·自由基的清除能力。

表 5番茄提取物对DPPH自由基的清除率 (%)

Table 5 Scavenging rates of tomato extraction on DPPH free radicals

2.5 热处理对番茄提取物总抗氧化能力和总还原能力的影响

总抗氧化和还原能力是抗氧化活力的一个重要的标志，吸光度越大，还原力就越大，抗氧化能力就越强^{[20, 21]}。番茄热处理前后都表现出一定的抗氧化能力和总还原力（见表6），但是在热处理前后差异显著。从表6可以看出，番茄提取物具有较高的抗氧化能力和还原能力，热处理后的总抗氧化能力为29.10 U/L，而对照组为17.39 U/L，热处理之后的番茄提取物总抗氧化能力明显高于对照组。热处理后的原提取物的吸光度值为2.05，而对照组原提取物的吸光度值为0.97。热处理组的吸光度值明显高于对照组，说明热处理后还原能力增强。

表 6 番茄提取物的抗氧化能力和总还原能力

Table 6 T-AOC and total reducing capacity of different rice extract

2.6 热处理后番茄提取物对LO₂细胞增殖率的影响

（1）热处理后番茄提取物对正常LO2细胞的影响 通过实验可得：当加入最大量（20倍稀释）时，对照组和热处理组对LO2细胞的增殖活性均无影响。说明热处理前后番茄提取物对LO2无明显毒性。

表 7 番茄提取物对正常LO₂细胞的增殖抑制率（%）

Table7 Inhibition rate of tomato extraction on the proliferation of LO2 cells.