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二噁英生物检测法在造纸行业的应用与实践
陈燕，朱日龙，罗岳平，毕军平，谢沙，龙雯琪，朱颖
（湖南省环境监测中心站，长沙 410019）
摘 要：由于目前二噁英标准分析方法所需仪器设备价格高昂，难以普及，从国外新引进的二噁英生物检测法因其费用较低和操作简便已受到普遍重视。为研究生物法的可行性和适用性，本文通过生物法与仪器法对比，得出两种方法的换算系数，并结合造纸行业标准要求，利用二噁英生物检测法对本区域内典型造纸企业进行了二噁英检测。表明二噁英生物法适用于造纸行业的二噁英检测，可以作为仪器法的补充进行推广而为环境管理提供参考。
关键词：二噁英；生物检测法；仪器法 ；造纸行业
Application and practice of dioxin biological detection in papermaking industry
Chen Yan，Zhu Ｒilong，Luo Yueping，Bi Junping，Xie Sha，Long Wenqi，Zhu Ying
（Hunan Environmental Monitoring Center Station，Changsha 410019，China）
Abstract: Because the equipment required for the standard analysis method of dioxin is expensive and difficult to popularize, the dioxin biological detection method which is newly introduced from abroad has got widespread attention because of its low cost and ease of operation. In order to study the feasibility and applicability, this paper compares biologic methods with instrumental methods to obtain the conversion factors of the two methods. In combination with the standard requirements of papermaking industry, dioxin biological detection method is used to monitor the typical papermaking enterprises in the region. It shows that dioxin biological method is suitable for the detection of dioxin in the paper industry, and can be used as a supplement to the instrument method to provide reference for environmental management.
Key words: Dioxin;Biological detection method;Instrumental method;Paper industry
作者简介：陈燕( 1984 － ) ，女，湖南湘乡人，湖南省环境监测中心站工程师，硕士研究生。
二噁英类物质，包括多氯代二苯并二噁英（PCDDs）、多氯代二苯并呋喃（PCDFs）和多氯联苯（PCBs），是典型的持久性有机污染物，对人类的健康和生态环境危害极大。根据氯原子取代数目和位置不同，二噁英类物质一共有400多种同类物。其中2，3，7，8-TCDD是目前已知毒性最大的物质。2001年5月在瑞士包括我国在内的90多个国家签署了《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》。根据公约，各个缔约国一致采取行动对12中优先持久性有机污染物进行控制，其中毒性最强、对生态影响最大、污染控制难度最大的就是二恶英类物质。在我国,制浆造纸行业被列为二噁英优先控制的重点行业之一，《制浆造纸工业水污染物排放标准》等对二噁英的排放限值做出了要求。
目前，国内二噁英实验室所采用同位素稀释高分辨气相色谱-高分辨质谱法（HRGC-HRMS）所需仪器设备和检测费用价格高昂，难以普及，而从美国、日本、欧盟等引进的二噁英生物检测法因为其费用较低和操作简便已受到发达国家和发展中国家的普遍重视，具有一定的发展前景[1]。近年我省已在全球环境基金“中国制浆造纸行业二噁英减排项目”支持下成立二噁英生物检测实验室，通过将二噁英生物法与仪器法结果进行对比，以及生物法的应用实验，以表明生物法可以作为仪器法的补充对区域内典型制浆造纸企业开展二噁英生物检测。
二噁英生物检测选用的是荧光素酶报告基因法（CALUX），此种方法是报告基因法分析二噁英的一种。报告基因法是以二恶英与Ah受体结合为原理建立的一种以细胞培养为基础的方法。环境中的二恶英与细胞中的Ah受体结合后，进入细胞核与核转位因子(ARNT)结合，然后再与结合了二恶英反应单元(DRE)和荧光素酶基因的基因结合，从而导致发光，发光强度和二恶英的量成正比，从而来测定二恶英的量[2]。根据使用不同的细胞，以及加入不同数目的二恶英反应单元，从而延伸出不同的报告基因方法。CALUX法采用的细胞是小鼠肝癌细胞。
一、主要仪器和试剂
主要仪器包括JF 602全自动样品净化系统，ASE 350加速溶剂萃取仪，Organomation N-EVAP氮吹仪，Spectra Max L酶标仪等，主要试剂包括正己烷、丙酮、乙酸乙酯、甲苯、二氯甲烷、胎牛血清、细胞培养用抗生素、胰蛋白酶、PBS等。
二 样品的前处理
二噁英样品前处理过程一般包括样品的预处理、提取、净化和浓缩，其中主要步骤是提取和净化。使用加速溶剂萃取法提取经富集后的二噁英样品。由于环境介质中二噁英类样品组成复杂，提取后还需经过若干净化步骤以达到将待测组分与其他干扰物质分离目的。样品前处理使用进口的全自动净化系统进行样品的净化。
三 细胞的培养
生物检测细胞的培养是一个较复杂的过程，包括细胞的复苏、传代、接种、给药等过程。每一步都需严格按照细胞实验要求进行，以免细胞失活或被污染。
四 标准曲线的建立
将50 µg/ml 的2, 3, 7, 8-TCDD标准原液稀释成250 ng/ml的低浓度保存液后按表1配成10个浓度梯度的标准曲线。以化学发光值（RLU值）为纵坐标，与浓度成一定关系的对数值为横坐标，绘制标准曲线如图1所示。
表1 2, 3, 7, 8-TCDD标准曲线浓度一览表
|
标准品 |
ng/ml |
|||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
|
|
TCDD |
0.0488 |
0.0971 |
0.195 |
0.391 |
0.781 |
1.56 |
3.13 |
6.25 |
12.5 |
25 |
图1 生物检测标准曲线
五 标准样品检测结果
经过对标准样品进行生物法检测，所得结果汇总如表2。
表2 二恶英标准样品分析结果
|
样品名称 |
单位 |
第一次 |
第二次 |
第三次 |
平均值 |
标准差 |
变异系数CV(%) |
|
纸厂污泥 |
pg-TEQ/g |
5.82 |
10.47 |
6.82 |
7.70 |
2.00 |
25.94 |
|
标准样品1 |
pg-TEQ/µL |
3.31 |
5.69 |
4.96 |
4.65 |
0.99 |
21.37 |
|
标准样品2 |
2.63 |
4.23 |
2.29 |
3.05 |
0.84 |
27.65 |
|
|
标准样品3 |
2.19 |
2.50 |
1.90 |
2.20 |
0.24 |
11.10 |
|
|
标准样品4 |
1.46 |
2.06 |
1.10 |
1.54 |
0.40 |
25.86 |
|
|
空白结果 |
未检出 |
0.03 |
未检出 |
/ |
/ |
/ |
根据要求，每个样品在三次重复实验中检测值的变异系数在30%以下即为合格。从表2结果可知，生物检测样品结果合格。
六 二噁英生物法与仪器法对比
为验证二噁英生物法在造纸行业的适用性，对某纸厂的二噁英样品进行了生物法和仪器法比对实验，两种方法二噁英检测结果见表3。
表3 生物法和仪器法比对实验结果
|
样品类型 |
单位 |
监测点位 |
生物法结果 |
HRGC/HRMS结果 |
|
漂后浆 |
（pg-TEQ /L） |
漂白车间出口 |
1.04 |
0.6 |
|
漂白废水 |
漂白车间出口 |
2.88 |
1.3 |
|
|
脱水污泥 |
（pg-TEQ /g） |
脱水污泥 |
21.44 |
15.6 |
|
纸产品 |
纸产品 |
2.52 |
1.3 |
从表5中4个样品生物法和仪器法结果来看，生物法的结果分别是1.04、2.88、21.44、2.52 pg-TEQ /L，对应的仪器分析法的结果分别是0.6、1.3、15.6、1.3 pg-TEQ /L，两组数据呈现出线性关系（如图2所示），线性方程斜率为1.33，即生物法是仪器法的1.33倍，相关性为R2=0.99，换算系数为0.75，将生物法的结果换算后为0.78、2.16、16.08、1.89，再与仪器法结果比较，其值基本在仪器法值的0.5-2倍之间，符合相关标准的要求[5]，表明该方法可行。且黎雯、徐盈等研究表明生物法所测得TEQ值均高于仪器法所测得的TEQ值[4]。
七 实际样品生物法检测
为了进一步验证生物法的适用性，表4列出了几家典型的非木浆造纸企业近三年来的二噁英生物法测定结果（企业基本情况见表5）。其中，2015年样品类型包括漂前浆、漂后浆、漂白废水、总排口出水、脱水污泥、纸产品等，2017年和2018年按照《制浆造纸工业水污染物排放标准》要求对纸厂A和纸厂B等漂白车间废水进行了二噁英监测。
表4 造纸企业二恶英样品分析数据
|
样品类型 |
单位 |
企业名称 |
监测点位 |
生物法结果 |
||
|
2015年 |
2017年 |
2018年 |
||||
|
漂前浆
|
（pg-TEQ /L） |
纸厂A |
漂白车间入口 |
0.14 |
/ |
/ |
|
纸厂B |
0.07 |
/ |
/ |
|||
|
漂后浆
|
纸厂A |
漂白车间出口 |
1.04 |
/ |
/ |
|
|
纸厂B |
0.72 |
/ |
/ |
|||
|
漂白废水
|
纸厂A |
漂白车间废水排放口 |
2.88 |
0.96 |
0.82 |
|
|
纸厂B |
1.08 |
0.84 |
17.9 |
|||
|
纸厂C |
/ |
1.85 |
/ |
|||
|
纸厂D |
/ |
0.65 |
/ |
|||
|
总排口出水
|
纸厂A |
总排口 |
0.48 |
/ |
/ |
|
|
纸厂B |
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