枯草芽孢杆菌MB8儿茶酚型铁载体的合成与结构分析

杨肖静，朱慧明，黄志伟，张志强，牛津徽，杨洪江

（1.天津科技大学生物工程学院，工业微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津 300457；2.北京化工大学生命科学与技术学院 北京100029）

摘要：本文对枯草芽孢杆菌MB8合成铁载体的条件及铁载体结构进行了研究。当甘油浓度为4%（v/v），精氨酸浓度为1.5 g/L，接种量为7%时，铁载体产量达到最大（SU=92.58%）。培养基中游离Fe³⁺浓度的增加，铁载体产量逐渐下降；当Al³⁺浓度为100 μmol/L时，能够显著提高铁载体的合成。菌株MB8分泌的铁载体能够促进不溶性针铁矿的溶解，溶解速率比对照提高了6倍。最后，采用质谱分析等技术对菌株MB8分泌的铁载体结构进行了分析，结果显示MB8合成的铁载体与已知铁载体Bacillibactin结构相似。

关键词：铁载体；枯草芽孢杆菌；不溶性针铁矿；Bacillibactin

Biosynthesis and structure analysis of the catechol siderophore produced by Bacillus subtilis MB8

YANG Xiao-jing¹, ZHU Hui-ming¹, HUANG Zhi-wei¹, ZHANG Zhi-qiang², NIU Jin-wei², YANG Hong-jiang^1*

（1. Tianjin University of Science and Technology, Key Laboratory of Industrial Microbiology, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin 300457；2. College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029）

Abstract：The aim of this study is to optimize fermentation parameters and analyze the structure of the siderophore produced by Bacillus subtilis MB8. The siderophore production was at the highest level (SU=92.58%) when the medium contained 40 mL/L glycerol, 1.5 g/L arginine, and 7% inoculum. Along with the increased concentration of Fe³⁺ in medium, MB8 produced less and less siderophore. When Al³⁺ was supplemented at 100 μmol/L in medium, siderophore production can be significantly increased. In biomining process the MB8 siderophore can significantly dissolve ferrin ions from goethite, 6 times higher than the control experiment. Finally, with mass spectrometry analysis the siderophore was identified with the structure similar to Bacillibactin.

Keyword：siderophore, Bacillus subtilis, insoluble goethite, Bacillibactin

细菌和真菌产生的铁载体，是一类对Fe³⁺具有较高亲和力的小分子金属离子螯合物（500-1500 daltons），主要功能是为细胞提供铁营养成分^[1]。铁载体根据官能团的不同主要分为氧肟酸型、儿茶酚型和柠檬酸型三类^[2]；而根据铁载体的结构进行分类，主要分为线性结构和环状结构。尽管铁载体之间存在很多的差异，但多数借助带负电荷的氧原子与Fe³⁺结合，六个配体与一个Fe³⁺形成最常见的六面体或八面体结构^[3]。随着研究的深入，大量铁载体的相似物被发现，例如与ferrioxamines结构相似的铁载体就高达20种^[4]。这些类似物的不同之处在于侧链上的短肽，这些多肽为Fe³⁺结合提供了最适的结合位点，同时还保护铁载体免受水解酶的破坏作用。

铁载体一方面为生物提供铁营养成分，维持微生物的正常生长。另一方面，某些铁载体不仅能螯合Fe³⁺，还能与Al³⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺等金属离子结合^[5]。铁载体DFOB在高pH值下，与钴离子的螯合能力大于铁离子，在对矿山废弃物或者金属污染的土壤进行生物修复时，可以使用铁载体清理重金属离子，对于环境的生物修复具有重要应用价值^[6]。东方拟无枝酸菌Amycolatopsis orientalis产生的铁载体EDDS以及根瘤菌Rhizobium meliloti产生的铁载体rhizobactin，被认为是天然的生物可降解的APCAs型螯合剂，能够替代合成螯合剂，与不同金属形成络合物，同时不污染环境，是一种经济且环境友好的技术^[7]。

本论文对枯草芽孢杆菌MB8产生铁载体的培养条件、铁载体的类型及分子结构、铁载体的抗氧化作用以及促进不溶性针铁矿溶解的功能等方面，进行了分析，研究结果将为枯草芽孢杆菌MB8的可能应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养基及其主要溶液

LB（Luria-Bertani）培养基主要用于细菌的常规培养，MKB（Modified King B）培养基主要用于对常见致病菌的培养，察氏培养基（Czapek Dox Medium）主要用于霉菌的培养。

AM（Arginine Medium）培养基^[8]主要用于培养菌株产生铁载体，成分为K₂SO₄ 1 g/L、CH₃COONH₄ 3 g/L、MgSO₄ 0.8 g/L、ZnSO₄ 0.0086 g/L、MnSO₄ 0.113x10^-3 g/L、葡萄糖20 g/L、精氨酸1.5 g/L、Na₂HPO₄ 3 g/L，调pH至7.0。

CAS（Chrome Azurol S）溶液^[9]主要用于检测铁载体，成分为铬天青S 1.21 g/L、十六烷基三甲基溴化铵（HDTMA）1.82 g/L、FeCl₃（溶于10 mmol/L HCl）0.27 g/L、无水哌嗪30.24 g/L，调pH至5.6。

Arnow试剂主要用于检测儿茶酚型铁载体，成分为0.5 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、10 g钼酸钠和10 g亚硝酸钠，溶解于部分去离子水中，待完全溶解后体积补至100 mL^[10]。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）溶液，含有400 μmol/L DPPH，溶于80%的无水甲醇。

1.2铁载体对常见致病菌的抑制作用

将菌株分别在终浓度为0 μmol/L和100 μmol/L Fe³⁺的培养基中培养，培养液10000 r/min离心10 min，0.22 μmol/L滤膜过滤，将滤液以20%的体积比接种到MKB培养基（真菌采用察氏培养基）中，然后接种指示菌，以只接种指示菌的培养基为对照，24 h后测定指示菌的生物量，计算抑菌率^[11]。

                                         公式1

1.3 正交设计

为了确定最佳铁载体产生条件，选取甘油、精氨酸、接种量这三个因素，以铁载体产量SU为指标，设计正交实验^[12]，实验因素水平见表1。

                                                                公式2

（注：Ar是未接种的培养基与等体积CAS混合后的OD₆₈₀，As是菌株上清与等体积CAS混合后的OD₆₈₀）

表1  正交实验设计各因素及水平

Table 1  Levels of factors used in the orthogonal experimental design

1.4 金属离子对铁载体产量的研究

1.4.1 2, 3-二羟基苯甲酸标准曲线的绘制

为了定量分析菌株MB8产生的儿茶酚型铁载体的含量，分别配置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L的2, 3-二羟基苯甲酸（DHBA）标准溶液，Arnow试剂检测，以OD₅₁₀的吸光度值为纵坐标，以DHBA的浓度为横坐标，绘制DHBA标准曲线。

1.4.2 Fe³⁺对菌株铁载体产量的影响

在培养基中添加Fe³⁺，使Fe³⁺的终浓度分别为0、0.1、0.5、1.0 μmol/L，36 h后测定菌株的生物量OD₆₀₀和铁载体产量，同时取1 mL菌液梯度稀释涂板计数。

1.4.3 Al³⁺对菌株铁载体产量的影响

为了比较铁载体对Fe³⁺和Al³⁺的螯合能力，将常规的CAS溶液中的Fe³⁺用等体积等浓度的Al³⁺替代，然后取1 mL菌株MB8的无细胞上清液与两种CAS溶液混合，室温下静置1 h后测定OD₆₈₀，以培养基为阴性对照；在培养基中添加Al³⁺，使其Al³⁺的终浓度分别为0、20、50、100 μmol/L，36 h后测定菌株的生物量OD₆₀₀和铁载体产量，同时取1 mL菌液梯度稀释涂板计数。

1.4.4 Cu²⁺对铁载体产量的研究

在培养基分别添加终浓度为0、20、50、100 μmol/L的Cu²⁺，36 h后测定菌株的生物量OD₆₀₀和铁载体产量，同时取1 mL菌液梯度稀释涂板计数。

1.5 铁载体对不溶性针铁矿的溶解研究

1.5.1 不溶性针铁矿（goethite）的制备

将180 mL 氢氧化钾（5 mol/L）加入到100 mL硝酸铁（1 mol/L）溶液中，迅速加入去离子水至体积为2 L，70°C下加热60 h，待冷却至室温后去离子水洗涤至上清pH值为中性，真空冷冻干燥12 h后得到土黄色粉末状物质，使用将其前加入到三角瓶中，121°C灭菌20 min^[13]。

1.5.2 铁载体对不溶性针铁矿的溶解利用

菌株MB8在终浓度为0 μmol/L和100 μmol/L Fe³⁺的培养基中培养36 h后，发酵液经离心过滤后，在每个已分装有3mg自制无菌针铁矿（goethite）的三角瓶中加入30mL不同铁载体含量的无细胞滤液，30°C、150 r/min培养，每隔12 h取出一瓶，10000 r/min离心5 min除去不溶的针铁矿，-80°C下预冻24 h，真空冷冻干燥12 h，加入15 mL纯净水，充分溶解后，利用原子吸收分光光度法测定溶液中铁的含量^[14]。

1.6 铁载体结构的初步鉴定

1.6.1 铁载体的溶剂萃取

10000 r/min离心菌株MB8发酵液10 min，10 kDa截留量的聚砜中空纤维柱超滤，滤液用6 mol/L HCl调pH值为2.0，用1/2体积的乙酸乙酯萃取三次，弃水相保留有机相，0.1个真空度30°C旋蒸，沉淀溶于无水甲醇，0.22 μm有机滤膜过滤后4°C下保存^[15]，为铁载体粗提液。

1.6.2 液质联用对铁载体结构进行初步分析

（1）全波长扫描

对含有铁载体的溶液进行全波长扫描，确定菌株MB8铁载体的吸收波长。

（2）HPLC-ESI-MS

将上述得到的菌株MB8铁载体粗提液进行高效液相色谱检测，条件设置分别为：色谱柱类型：Phenomenex Luna C18（5 μm）；流动相：5%乙腈（0.1%甲酸）-100%乙腈（0.1%甲酸）；柱温：25°C；离子源：ESI；离子极性：负离子；扫描范围：100-1000 m/z。

（3）UPLC-ESI-MS/MS

利用Waters UPLC-Quattro Premier XE三重四级杆液质联用仪对菌株MB8产生的儿茶酚型铁载体进行进一步的分析，该仪器配有Waters ACQUITY UPLC® BEH C18（1.7 μm，2.1*100 mm柱子），一级质谱的扫描范围是100-1000 m/z，二级质谱的扫描范围是50-950 m/z，二级质谱碰撞能量为10 V、20 V、30 V和40 V。

1.7 铁载体抗氧化作用的研究

铁载体具有的抗氧化能力通过对DPPH自由基清除能力来表示，对DPPH的清除能力越大，说明儿茶酚型铁载体的抗氧化能力越强。菌株分别在含有0 μmol/L和100 μmol/L Fe³⁺浓度的培养基中培养36 h，铁载体产量SU分别为91.99%和1.01%，发酵液经酸化和乙酸乙酯萃取处理，得到的溶液旋蒸至干，甲醇溶解后，稀释1000倍后取不同体积（0，0.2，0.4，0.6，0.8和1 mL）于试管中，补加甲醇至2 mL，然后再分别添加2 mL DPPH溶液，避光室温下反应30 min后测定517 nm处的吸光度值^[16]。

                                             公式3

（A₁.样品和DPPH混合30min后的OD₅₁₇；A₂.甲醇和DPPH混合30min后的OD₅₁₇；A₃.样品和甲醇混合30min后的OD₅₁₇）

2 结果与讨论

2.1 铁载体对常见致病菌的抑制作用

B. mojavensis SS05是目前发现的产铁载体菌株中铁载体产量最高的，SU=98.3%，在低铁条件下对F. oxysporum有显著抑制作用；从烟草根际中筛选到的P. mediterrane G.229.21产生的羧酸型铁载体，对Fe³⁺有较高亲和力，SU为80.3%，在低铁条件下对烟草疫霉的抑制率达92.3％，而在富铁条件下抑制率仅为2.0％^[17]。用CAS法测出的铁载体分泌量与病原菌的抑制作用，并不完全正相关。有研究认为铁载体对病原菌的抑制作用在种的水平上具有选择性，也就是说铁载体产量高不一定抑菌效果强，必须采用生物测定的方法，才能判断这些铁载体对某种病原菌是否有直接的拮抗作用^{[18, 19]}。

如图1所示，菌株MB8的高铁载体含量的培养液（SU=74.11%）对常见指示菌均具有抑制作用，对真菌毛霉和藤黄微球菌的抑制率最大，分别为80.67%和80.41%，低铁载体含量的培养液（SU=0.90%）也对指示菌有部分抑制作用，说明菌株MB8除了分泌铁载体，还分泌其它具有抑菌活性的物质。

（注：a. 藤黄微球菌；b. 金黄色葡萄球菌；c. 大肠杆菌；d. 副溶血性弧菌；e. 普通变形杆菌；f. 鲍曼不动杆菌；g. 嗜水气单胞菌；h. 毛霉）

图1 菌株MB8不同含量的铁载体对常见致病菌的抑菌率

Figure 1．The inhibition efficiency of MB8 siderophore concentration on common pathogenic strains

2.2 菌株MB8分泌铁载体条件的优化

选取甘油、精氨酸、接种量为单因素，选用L₉(3⁴) 正交表安排实验。根据表2的极差分析结果可以看出，对MB8铁载体产量影响的主次顺序是甘油>接种量>精氨酸；从表3的正交结果方差分析显示，区间组F=2.56，概率P=0.1480>α=0.05，说明区间组差异不显著，即可不考虑因素之间的交互作用；A（甘油）因素F=19.32，概率P=0.0009<α=0.01说明甘油浓度对铁载体产量的影响极为显著；B（精氨酸浓度）因素F=0.99，概率P=0.4129>α=0.05，说明B精氨酸浓度的改变对菌株铁载体产量影响不显著；C因素F=4.37，概率P=0.0522>α=0.01，略大于α=0.05，说明接种量对菌株铁载体产量影响微显著。综上可得最优的培养条件为甘油浓度4%（v/v），精氨酸浓度1.5 g/L，其余成分保持不变，接种量为7%。

表2 L₉(3⁴) 铁载体产量正交实验结果

Table 2． Orthogonal experiment results of siderophore-production

 表3 正交实验方差分析

Table 3． ANOVA of orthogonal experiment

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