二次回归正交旋转组合设计对木瓜多糖提取工艺的优化

王中来，李宝珠，苏诗蟠，邓奕琪

摘要：采用超声浸提法，以木瓜多糖得率为指标，运用二次回归正交旋转组合设计建立回归方程，优化木瓜多糖的提取工艺。建立回归方程为：

该模型的相对误差为1.8﹪；确定各因素对多糖得率的影响顺序为：液固比>超声时间>水浴时间>水浴温度。液固比、超声时间和水浴时间对多糖得率的影响均为极显著。在超声时间46.5 min、液固比34:1（ml/g）、水浴时间44.5 min和水浴温度49.5℃的最佳工艺条件下，木瓜多糖得率达16.5%。建立的回归方程对木瓜多糖提取具有良好的预测作用。

关键词：木瓜；多糖；提取；二次回归正交旋转组合设计

中图分类号：TQ028.8

Optimization of Extraction of Papaya Polysaccharide by Quadratic Regression Orthogonal Rotational Combination Design

Wang Zhonglai¹,Li Baozhu^2，1, Su shipan³,  Deng Yiqi⁴

(1.College of Biological Engineering,Fuzhou University, Fuzhou 350116, Fujian,China;2. Department of Medical Examination and Preventive, Quanzhou Medical College, 362000, Fujian, China;3. Xiamen Biosteed Gene Co., Ltd，Xiamen, Fujian 361002; 4. Department of Biotechnology, Fuzhou University Zhicheng College, Fuzhou, Fujian 350002)

Abstract:The extraction process of papaya polysaccharide was optimized by using the method of ultrasonic extraction and the yield of papaya polysaccharide as the index. The regression equation was established by using quadratic regression orthogonal rotation design.The regression equation is as follows.

,

The relative error of the model was 1.8%. The order of influence of each factor on the yield of polysaccharide was as follows: liquid to solid ratio> ultrasonic time> water bath time> water bath temperature.Liquid-solid ratio, ultrasonic time and water bath time on the yield of polysaccharides were extremely significant.The yield of papaya polysaccharide was 16.5% under the optimum conditions of ultrasonic time 46.5 min, liquid-solid ratio 34: 1 (ml / g), water bath time 44.5 min and water bath temperature 49.5 ℃.The established regression equation has a good predictive effect on the yield of papaya polysaccharide.

Key words: Papaya; polysaccharide; extraction; quadratic regression orthogonal rotation combination design

木瓜为蔷薇科植物，作为一种药食两用的植物资源，富含17种以上蛋白质、氨基酸、木瓜蛋白酶、番木瓜碱、膳食纤维以及多种维生素，并含有钙、铁等物质，具有疏经活络及和胃化湿等功能^[1]。多糖是存在于自然界的醛糖或酮糖通过糖苷键链接在一起的聚合物，上世纪50年代，人们发现中草药中的多糖具有多种药理活性^[2-3]，其不仅可以作为广谱免疫促进剂^[4]，调节机体免疫功能，还有抗凝血、抗病毒、降血糖、抑感染及防肿瘤等药理作用^[5-6]。

目前，关于木瓜多糖的提取工艺的优化，已有较多报道，但是优化方法大多采用传统的正交试验方法^[7-8]。目前尚无利用二次回归正交旋转组合设计法优化木瓜多糖提取工艺的研究报道。本研究在传统木瓜多糖提取工艺的基础上，利用超声浸提法提取木瓜多糖，并运用二次回归正交旋转组合设计法优化提取工艺^[9]，得到回归模型，为木瓜多糖的开发利用提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

木瓜：产于海南。

试剂：蒽酮、无水葡萄糖、浓硫酸，所用试剂均为国产分析纯。

仪器：SB-02型多功能粉碎机，上海市浦恒信息科技有限公司；DHR-100SB电热鼓风干燥箱，广东医疗器械厂；DK-S26恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；UV900紫外可见分光光度计，Perkin Elmer公司；AVANTI TMJ-251高速离心机，BECKMAN公司；KQ5200E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 木瓜多糖的提取

采用超声浸提法^[10]提取木瓜多糖：将新鲜木瓜削皮、去籽，切成厚约2～5 mm的片状，然后置于60.0 ℃烘箱中干燥至恒重，经粉碎后过40目筛，储存于干燥器中，备用。准确称取1.00 g木瓜粉于三角瓶中，加入一定量的蒸馏水，经超声波处理后，置于水浴锅中用热水浸提，随后将浸提液用12000 r/min的高速离心机离心10 min，用蒸馏水洗涤滤渣，合并滤液，定容，即得到木瓜多糖提取液。

1.2.2 木瓜多糖的测定

采用蒽酮-硫酸法^[11-12]测定木瓜多糖提取液中的多糖含量。木瓜多糖得率的计算公式如下：

                                   (1)

式中：y—木瓜多糖得率（%）；C—提取液中木瓜多糖的浓度（g/ml）；V—提取液体积（m1）；m—木瓜粉质量（g）；F—稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1超声时间对多糖得率的影响  

图1 超声时间对多糖得率的影响

Fig.1 Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharide

在水浴温度 60℃、水浴时间 40min及液固比 50:1条件下，超声时间对多糖得率的影响如图1所示。在超声时间10～60 min范围内，多糖得率呈先增加后减少的趋势，在30min时达到最大值。说明超声波处理可提高木瓜多糖的得率，增加超声波处理时间可延长超声波辐射压强产生的强烈空化效应的作用，增加溶剂穿透力，从而使多糖逐渐释放出来并向溶剂中溶出，使木瓜多糖的得率提高^[13]。但是长时间的超声波处理导致已经溶解出来的多糖的结构发生改变甚至是降解，使得到的多糖含量下降^[14]。

2.1.2液固比对多糖得率的影响

图2 液固比对多糖得率的影响

Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of polysaccharide

在超声时间 30min、水浴温度 60℃和水浴时间 30min条件下，液固比对多糖得率的影响如图2所示。在液固比10:1～60:1的范围内，随着液固比的增加多糖得率呈先增加后减少的趋势，变化的幅度比较大，说明液固比对多糖得率的影响较大，当液固比为40:1时达到最大值。但是液固比越大，在浓缩过程中消耗的时间和能量就越多^[8]。

2.1.3 水浴时间对多糖得率的影响

在超声时间 30min、水浴温度 60℃及液固比为40:1条件下，水浴时间对多糖得率的影响如图3所示。在水浴时间10～60 min范围内，多糖得率呈先增加后减少的趋势，且在水浴时间30 min时达到最大值。水浴时间在50min以后，曲线趋于平稳，可能是水浴时间越充分，溶剂对物料的作用也越来越充分，水溶性成分的提取率也随之增大，当达到一定时间后，溶液的渗透压体系达到平衡，多糖得率也不再增加^[15-16]。

图3 水浴时间对多糖得率的影响

Fig.3 Effect of Water-bath time on the yield of polysaccharide

2.1.4水浴温度对多糖得率的影响

图4 水浴温度对多糖得率的影响

Fig.4 Effect of Water-bath temperature on the yield of polysaccharide

在超声时间 30min、水浴时间30min及液固比为40:1条件下，水浴温度对多糖得率的影响如图4所示。在水浴温度40～90℃范围内，多糖得率逐渐增加，在70℃时，木瓜多糖得率达最大值，然后开始缓慢下降。可能是因为随着水浴温度的升高，溶液的表面张力、介电常数降低，促使多糖类物质溶解越来越充分，使得多糖得率不断上升，同时使布朗运动更为激烈，有利于多糖分子的传质扩散，从而使多糖得率增加^[17]。但是水浴温度过高导致多糖的糖苷键断裂而降解，使得最后测得的多糖含量下降，使多糖得率下降^[18]。

2.2木瓜多糖提取工艺的优化

2.2.1 因素水平编码

在单因素实验的基础上确定因素水平编码范围，见表1，选取超声波处理时间Z₁（min）、液固比Z₂（ml/g）、水浴时间Z₃（min）和水浴温度Z₄（℃）四个因素，应用四因素二次回归正交旋转组合设计进行优化^[19]。编码公式：

                                     (2)

表1 因素水平编码表

Tab.1 Factors and levels coding table

四因素二次回归正交旋转组合设计结构矩阵及数据见表2，以木瓜多糖得率y为实验指标，用excel软件处理数据，得到回归方程如下:

   (3)

2.2.2 显著性检验

显著性检验结果见表3。回归方程在α=0.01水平上极显著。方差来源、、、、在α=0.01水平上极显著，、、、在α=0.05水平上显著。通过对回归方程的显著性检验可知，对木瓜多糖得率产生影响的主次顺序为>>>, 即液固比>超声时间>水浴时间>水浴温度。剔除不显著项，对回归方程(3)进行优化，得到回归方程如下：

  (4)

2.2.3 零水平重复实验

在中心试验点处有12次重复实验，用由此产生的误差平方和对失拟平方和进行失拟检验，结果如下所示：

               (5)

由计算结果可知，失拟项不显著，说明该回归方程在中心点拟合较好，即可利用该方程对不同提取条件下的木瓜多糖得率进行预测。

2.2.4 最佳工艺条件的确定

二次项中心化处理公式为：

                                      (6)

根据二次项中心化处理公式(6)和编码公式(2)对因素进行还原得到回归方程：

  (7)

对公式(7)求解得到最佳条件为Z₁=46.5、Z₂=34.4、Z₃=44.5、Z₄=49.5，即超声波处理时间46.5 min，液固比34:1（ml/g）、水浴时间44.5 min、水浴温度49.5 ℃为最佳工艺条件。代入回归方程得y=16.8，即木瓜多糖得率预测值为16.8﹪。在最佳条件下进行三次平行实验，多糖的平均得率为16.5﹪，与回归方程的预测值相对误差仅为1.8﹪，说明采用二次回归正交旋转组合设计法优化得到的木瓜多糖提取工艺参数准确可靠。

本研究利用二次回归正交旋转组合设计法优化木瓜多糖提取工艺，在最佳工艺条件下木瓜多糖得率达16.5﹪，明显高于黄锁义等人^[7]和刘捷等人^[8]采用正交试验法优化工艺条件得到的木瓜多糖提取率12.81%和5.0%。因此，二次回归正交旋转组合设计法优化木瓜多糖提取工艺的优化效果优于正交试验法。

2.2.5 因素间交互作用分析

由表3可知，和的交互作用显著（α=0.05），因此探讨这两个交互作用。图5和图6是以公式(7)为基础并应用minitab16软件做出的响应曲面图，它们直观的反映了各实验因素与响应值之间的交互作用^[21]。

在液固比30:1和水浴时间30min的条件下，超声时间和水浴温度的交互作用对多糖得率的影响如图5所示。随着超声时间的延长，多糖得率逐渐增加；随着水浴温度的升高，多糖得率呈先增后降的变化趋势。在超声时间10min和水浴温度70℃时达到最大值。因此，在提取木瓜多糖时，通过选择最适超声时间并适当提高水浴温度可获得较高的得率。

图5 超声时间与水浴温度对多糖得率的影响

（液固比30:1和水浴时间30min时）

Fig.5 Effect of ultrasonic time and water bath temperature on the yield of polysaccharide

图6 水浴时间与水浴温度对多糖得率的影响

（液固比30:1和超声时间30min时）

Fig.6 Effect of water bath time and water bath temperature on the yield of polysaccharide

在液固比30:1和超声时间30min的条件下，水浴时间和水浴温度的交互作用对多糖得率的影响如图6所示。随着水浴时间的延长和水浴温度的增大，多糖得率呈现先增加后减少的变化趋势，在水浴时间30min和水浴温度70℃时达到最大值。因此，在提取木瓜多糖时，保持适宜的水浴时间和水浴温度有利于促进多糖的提取^[22]。

3 结论

本研究采用超声浸提法提取木瓜多糖，通过单因素试验和二次回归正交旋转组合设计试验优化提取工艺。建立回归方程为：

。得到最佳工艺条件：在超声时间46.5 min、液固比34:1（ml/g）、水浴时间44.5 min、水浴温度49.5℃条件下，木瓜多糖的得率达到最高，为16.5﹪，与回归方程的预测值基本一致，相对误差为1.8﹪，建立的回归方程对木瓜多糖提取具有良好的预测作用。各因素对多糖得率的影响顺序为：液固比>超声波处理时间>水浴时间>水浴温度。液固比、超声时间和水浴时间对木瓜多糖得率的影响均为极显著。

至于木瓜多糖提取过程中多糖活性的变化，将有待今后进一步探究。

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表2二次回归正交旋转组合设计及试验结果

Tab.2 Quadratic orthogonal rotary combination design and experimental results

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3	1	-1	-1	1	-1	1	-1	1	-1	1	-1	0.333	0.333	0.333	0.333	13.1