斛芪复合饮料对小鼠免疫功能影响的研究

刘翠翠，  郭东龙，王景雪（山西大学生命科学学院 山西 太原 030006）

摘 要：目的  通过小鼠碳廓清实验研究了斛芪复合饮料对小鼠免疫功能的影响。方法  通过对小鼠腹腔注射 80 mg/kg环磷酰胺（CTX）建造免疫低下模型，分别以环磷酰胺+斛芪复合饮料2000 mg/kg、环磷酰胺+斛芪复合饮料1000 mg/kg、环磷酰胺+斛芪复合饮料500 mg/kg剂量灌胃 小鼠，比较各组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数、计算胸腺指数和脾脏指数以及观察免疫器官病理切片。结果  斛芪复合饮料可以提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬指数，斛芪复合饮料高、中剂量组与模型组比较有极显著性差异(P＜0.01)。胸腺指数脾脏指数也有所增加，斛芪复合饮料高、中剂量组胸腺指数均高于模型组且差异具有极显著性（P＜0.01）。模型组的脾脏指数低于正常对照组，与高剂量组、中剂量组之间存在显著性差异（P＜0.05）。观察免疫器官病理切片也并未发现有严重损伤效果。结论  斛芪复合饮料对小鼠免疫功能具有显著增强作用。

关键词：斛芪复合饮料；小鼠；免疫功能；吞噬指数；碳廓清能力

Effects of Huqi compound beverage on Immune Function in Mice

LIU Cui-cui  GUO Dong-long*  WANG Jing-xue*

(School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006，China)

Abstract：Objective  The effect of Huqi Compound beverage on  immune function of  mice was studied by mouse carbon clearance experiment.Method An immunocompromised model was constructed by intraperitoneal injection of 80 mg/kg cyclophosphamide into mice,mice were intragastrically administered with cyclophosphamide + Huqi compound beverage 2000 mg/kg, cyclophosphamide + Huqi compound beverage 1000 mg/kg, and cyclophosphamide + Huqi compound beverage 500 mg/kg,The phagocytic index of peritoneal macrophages in each group of  mice was compared, the thymus index and spleen index were calculated, and the pathological sections of the immune organs were observed.Results Huqi compound beverage can increase the phagocytic index of peritoneal macrophages in  mice. There were significant differences between the high, middle dose groups of Huqi compound beverage and the model group (P<0.01). The thymus index of the thymus index also increased. The thymus index of the high, middle dose groups of the Huqi compound beverage was higher than that of the model group and the difference was significant（P＜0.01）.The spleen index of the model group was lower than that of the normal group, and there was a significant difference between the high dose group and the middle dose group (P<0.05). Observed pathological sections did not find serious damage effects. Conclusion Huqi compound beverage has a significant enhancement effect on immune function in mice.

Key words: Huqi Compound beverage ；  Mice； Immune Function； Phagocytic index； Carbon clearance ability

铁皮石斛（Dendrobium  officinale)在我国是一种濒危且有价值的传统名贵药用植物，素有“药中黄金”之称，已被广泛用于中医的健康预防，是一种高营养的健康食品，备受注重养生人群的喜爱^［1~2］。通过 CNKI 数据库检索，结合铁皮石斛现代药理学研究和临床应用的文献，总结出铁皮石斛有增强机体免疫、抗疲劳、抗氧化抗衰老、促消化、促进唾液分泌、降血糖、降血压、抗肝损伤、抗肿瘤等方面药理作用，同时也具有滋阴清热、生津益胃、润肺止渴、润喉明目、延年益寿等养生功效^［3］。铁皮石斛体外能促进脾细胞增殖，增加单核-巨噬细胞吞噬功能和 NK 细胞活性，明显增强小鼠免疫功能和体液免疫作用。铁皮石斛可作为有价值的一味免疫增强天然中药资源进行开发利用^［4］。近年来，有研究证明黄芪同时具有促进机体代谢， 增强和调节机体免疫功能的作用^［5，6］。 为进一步研究黄芪对免疫功能低下个体的保护作用。因此结合中医药基础理论与遵循中药配伍原则，将其与黄芪、百合等具有增强免疫的名贵中药配伍，制成斛芪复合饮料。降低成本的同时突出铁皮石斛提高免疫的功效^［3］。

本研究从单核-巨噬细胞功能和免疫器官病理切片角度探索斛芪复合饮料对ICR小鼠非特异性免疫功能的影响^［7］。

1材料与方法:

1.1材料 

1.1.1实验动物：纯系ICR雄性老鼠，体质量18~22 g（购于山西医科大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK（晋）2015—0001；使用许可证号：SYXK（晋）2015—0001）。所有实验动物均饲养于25 ℃±2 ℃的恒温恒湿房间。

1.1.2斛芪复合饮料：由本实验制备，按照现代科学技术优化比例将铁皮石斛与黄芪，百合等中药材制成复合饮料。称取50 g斛芪复合饮料溶于1000 ml蒸馏水中，搅拌均匀，置于40 ℃水浴超声30 min,取上清液

6000 r离心5 min,取澄清液使用旋转蒸发仪浓缩，温度控制在60 ℃，浓缩至100 ml，4 ℃保存备用^［8］。

1.1.3药品与试剂：CTX  印度墨水  0.1%Na₂CO₃

1.2方法

1.2.1给药与建模分组    

取清洁级ICR小鼠60只，按体重随机分成5组，每组12只，分别为模型组、正常对照组、环磷酰胺+高剂量组（2000 mg/kg）、环磷酰胺+中剂量组（1000 mg/kg）、环磷酰胺+低剂量组（500 mg/kg），适应性喂养一周。一周后的第一天起，除正常对照组外，模型组和高、中、低剂量组连续3天腹腔注射80 mg/kg 环磷酰胺,制造免疫抑制小鼠模型^［9、10］。正常对照组小鼠每天以等量生理盐水灌胃。建模成功后，按照高剂量组2000 mg/kg、中剂量组1000 mg/kg、低剂量组500 mg/kg连续灌胃 30 d，正常对照组与模型组灌胃 0.2 ml/d生理盐水。

1.2.2单核-巨噬细胞功能测定——小鼠碳粒廓清实验     

给药30 d后，按10 ml/kg计算,于尾部静脉注射稀释后的印度墨汁，待墨汁注入，立即计时。于2 min,10 min眼眦静脉丛取血，立即溶于0.1% Na₂CO₃溶液中吸打混匀，使用紫外可见分光光度计在600 nm 波长下测定吸光值。隔天颈椎脱臼处死后，解剖小鼠，取肝脏和脾脏并称重，计算廓清指数 K 和吞噬指数α^［11］。

廓清指数 K = ( 1og A₂-logA₁₀ ) /( t₂- t₁ )

注：式中A₂代表2 min溶液吸光值，A₁₀代表10 min溶液吸光值，t₂代表计时10 min,t₁代表计时2 min 。

吞噬指数

注：K代表廓清指数

1.2.3胸腺指数、脾脏指数测定

小鼠处死后，取胸腺及脾脏，称重，计算胸腺指数、脾脏指数。

胸腺指数= 胸腺重量（mg)/体重（g)×100%

脾脏指数= 脾脏重量（mg)/体重（g)×100%

1.2.4胸腺、脾脏组织的改变

将称重后的胸腺及脾脏剪取一部分迅速投于4 %的多聚甲醛，备用，制作石蜡切片，进行HE染色观察。

1.2.5统计学分析方法

各实验组计算结果用平均值±标准差 ( ±s)表示，用SPSS17.0软件进行数据整理与分析，方差分析，计算F值，采用单因素方差分析进行总体比较，LSD Duncan多重比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1斛芪复合饮料对ICR小鼠体重的影响  

按照1.2.1的方法灌胃小鼠30 d后，统计小鼠体质量，结果见图1。由表1可见，模型组及高、中、低剂量组小鼠体质量明显低于正常对照组，且与正常对照组相比有统计学意义（P＜0.01），中、低剂量组略高于模型组，说明斛芪复合饮料对由于免疫低下造成小鼠体质量减少有一定的修复作用，且与剂量有关。

图1 各组小鼠灌胃30 d后平均体质量

Fig. 1  Average body mass after 30 days of intragastric administration in each group of ICR mice

注:与正常对照组相比**P<0.01

2.2斛芪复合饮料对小鼠碳粒廓清能力的影响

按1.2.2的方法，测定了模型组、正常对照组和不同剂量组的碳粒廓清指数和吞噬指数，模型组的廓清指数、吞噬指数均显著小于正常对照组（P＜0.01），说明利用该方法建模成功，有效地造成了小鼠免疫低下。与模型组相比，三个实验组的廓清指数均高于模型组。且模型组与高剂量组有极显著性差异（P＜0.01）。从吞噬指数来看，与模型组相比，三个实验组吞噬指数显著增高，且高、中剂量组具有统计学意义（P＜0.01），结果见表1。说明斛芪复合饮料具有增强小鼠单核-巨噬细胞碳廓清功能的作用。  

表1    斛芪复合饮料对小鼠碳粒廓清能力的影响 ( ±s，n=8)

Tab.1 Effect of Huqi compound powder on carbon particle clearance ability of mice ( ±s，n=8)

注：与正常组相比：*P＜0.05，**P<0.01

    与模型组相比：#P＜0.05，##P＜0.01

2.3斛芪复合饮料对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响  

斛芪复合饮料饲喂免疫低下小鼠30 d后，分别称取各组小鼠的胸腺和脾脏以及体质量，计算出脏器指数。

模型组胸腺指数低于正常对照组，三个实验组与正常对照组相比差异都具有极显著性（P＜0.01），与模型组相比高、中剂量组差异具有极显著性（P＜0.01），低剂量组有显著性差异（P＜0.05）。模型组的脾脏指数低于正常组，而其中高剂量组与模型组和正常对照组相比都具有极显著性（P＜0.01），结果见表2，表明斛芪复合饮料具有促进小鼠免疫器官发育的作用，有助于提高小鼠的免疫力。

表2   斛芪复方剂对小鼠胸腺和脾脏指数的影响(±s，n=8)

Tab.2 Effect of phlegm and blood compound on thymus and spleen index in mice(±s，n=8)

注：与正常组相比：*P＜0.05，**P<0.01

    与模型组相比：#P＜0.05，##P＜0.01

2.4斛芪复合饮料对小鼠免疫器官的影响

2.4.1胸腺观察

模型组小鼠胸腺皮质薄于正常对照组，淋巴细胞大量减少。高、中剂量组小鼠胸腺胸小叶分明，皮质淋巴细胞密集，着色深。网状细胞清晰，胸腺组织与正常对照组接近。说明斛芪复合饮料可以增加淋巴细胞的发育。低剂量组小鼠胸腺淋巴细胞分布较稀疏，与模型组相近。说明斛芪复合饮料对由于免疫低下造成的胸腺淋巴细胞减少有修复作用，且有剂量效应。观察结果见图2。说明斛芪复合饮料对环磷酰胺致免疫低下的小鼠胸腺有修复保护作用。

高剂量组                    中剂量组                  低剂量组

正常对照组                         模型组

图2 各组小鼠胸腺病理观察图（HE ×10）

Fig.2 Pathological observation of thymus in each group of  mice (HE × 10)

2.4.2脾脏观察

模型组小鼠脾组织显著小于正常对照组。高剂量组小鼠脾组织中央动脉周围淋巴细胞分布密集，着色深，单核细胞存在，脾索、血窦分明；中剂量组小鼠脾组织红髓区变窄；低剂量组小鼠脾组织中央动脉周围淋巴细胞分散；各组小鼠脾组织未发现有明显损伤^［12］，观察结果见图3，说明斛芪复合饮料对环磷酰胺致免疫低下的小鼠脾脏发育有促进作用，从而提高小鼠免疫力。

高剂量组                中剂量组               低剂量组

               正常对照组                   模型组

图3 各组小鼠脾脏病理观察图（HE ×10）   

 Fig.2 Pathological observation of spleen in each group of  mice (HE × 10)

综上所述，斛芪复合饮料可以提高小鼠的免疫力，且有剂量效应。

3讨论  

斛芪复合饮料选用铁皮石斛、黄芪等名贵中药材，设计最优比例混合制成复方粉。根据中国中药化学成分数据库的资料，除了一些微量元素外，黄芪主要活性成分包括黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮类化合物等68 种有效化学成分。现代医学发现黄芪的药理作用是由其所含的有效成分所决定，而这些活性成分均具有增强机体免疫功能的作用^［13］。赵晓峰等研究显示黄芪对免疫功能低下的小鼠体液免疫功能和巨噬细胞吞噬功能具有增强作用。Wei 等^［14］研究显示黄芪多糖对免疫缺损小鼠的胸腺细胞具有保护作用，可降低其受损后的凋亡，从而改善胸腺功能，提高免疫力^［15］。宋燕华等^［16］研究了铁皮石斛叶对二代繁殖雌性大鼠免疫水平的影响。发现铁皮石斛叶能提高动物 NK 细胞活性，增强细胞免疫功能。程东等的实验也有类似结果^［18］。宋美芳等研究了齿瓣石斛多糖和铁皮石斛多糖对小鼠免疫功能的影响，发现两者均能促进脾淋巴细胞中γ－干扰素和白细胞介素－2 的分泌、增加小鼠足跖肿胀度和脾脏指数^［19］。李光等更是研究了4 种不同种属的石斛多糖对小鼠免疫功能的调节作用，其中铁皮石斛多糖和齿瓣石斛多糖效果较好^［20］。众多研究表明石斛确有提高免疫功能的作用。

免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官，前者包括胸腺、骨髓；后者包括脾脏、淋巴结、消化道、呼吸道及泌尿生殖道的淋巴结。免疫器官的发育状况会直接影响到机体免疫力的高低^［17］。单核巨噬细胞系统是高等动物和人的非特异性免疫系统之一 ,其功能主要表现为对颗粒性物质如外来的病毒 、细菌等病原体进行吞噬 、消化和清除 ,并分泌各种细胞因子。碳粒廓清实验就是利用单核巨噬细胞系统吞噬 、清除碳粒(颗粒性物质)以检测该系统对颗粒性物质的吞噬 、清除功能^［7］。

本实验从非特异性免疫功能角度研究了斛芪复合饮料对环磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的影响。结果表明，环磷酰胺致小鼠免疫功能低下,在ig 30 d斛芪复合饮料后吞噬指数高、中剂量组吞噬指数有明显增加，免疫器官指数也有提高，各项测定结果与模型组相比，均具有显著性差异，说明斛芪复合饮料对ICR小鼠非特异性免疫功能有明显的增强功效，且具有剂量效应。推荐剂量为每人每天1000 mg/kg。本研究仅从碳粒廓清能力和吞噬指数碳粒等方面研究了斛芪复合饮料提高ICR小鼠免疫力的作用，今后应从细胞免疫、体液免疫等方面更全面地研究斛芪复合饮料对提高小鼠免疫力功能的影响。

参考文献

[1] Meng Xu,  Xin Liu,  Jian-Wen Wang,  Shi-Yuan Teng,  Ji-Qing Shi,  Yuan-Yuan Li,  Min-Ren HuangCo-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University，Suzhou Shenyuan Bio-Tech Co., Ltd，Guizhou Academy of Sciences， Molecular Breeding, 2017, Vol.37 (2), pp.1-7

[2] Chunhua Zhou,  Zhenshan Xie,  Zhouxi Lei,  Yuechun Huang,  Gang Wei，School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine，The First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine，Chemistry Central Journal, 2018, Vol.12 (1), pp.1-9

[3] 陈素红，颜美秋，刘霞，等．铁皮石斛保健食品开发现状与进展［J］．中国药学志，2013，48 (10) :1625 －1628．

[4] 张中建，阎小伟.铁皮石斛制剂免疫调节作用的实验研究［J］.食品研究与开发，2004，25( 2) : 34-35.

[5] 刘莎，符州．黄芪的免疫调节作用及其临床应用［J］．国际中医中药杂志，2006，28（4）：203－205．

[6] Shao P， Zhao LH， Zhi C， et al．Regulation on maturation and function of dendritic cells by Astragalus mongholicus polysaccharides．Int Immunopharmacol， 2006，6 （7）：1161－1166．

[7] 吴江涛,刘 珂  紫锥菊提取物对小鼠单核巨噬细胞系统功能的影响［J］．烟台大学学报(自然科学与工程版)。2001.14(2)131-134

[8] 贾宁，王汉，郑晶．复方党参提取物对环磷酰胺处理小鼠免疫功能的调节作用[J]．中国实验方剂学杂志，2011，17(17):206-2086

[9] 王叔桥，张丽宏，李炎，等．参黄胶囊对环磷酰胺致免疫低下小鼠免疫功能的影响[J]．现代药物与临床，2013; 28(4)∶504－507

[10] 高芃，钱嘉林，刘长喜，等．环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立[J]．环境与职业医学，2004; 21( 4) ∶314 － 318

[11] 安静思，胡相卡，杨伟等.芪胶升白胶囊对正常小鼠及免疫抑制小鼠免疫调控作用的研究[J]．中国中医科学院中药研究所 中药药理与临床 2016; 32( 5)78-82

[12] 葛资宇，童骄，王小玉等．野生铁皮石斛超微颗粒对免疫缺陷小鼠免疫器官病理变化实验研究［J］．辽宁中医药大学学报，2015，17( 5) : 54 － 56

[13] 汤召峰，梁晓美  黄芪有效成份提高机体免疫功能的研究进展[J]．中国中医药科技，2014，5(21):341-344

[14] 刘立民，张彦明，陆沭华，等．黄芪多糖对浆细胞样树突状细胞功能及成熟的影响[J]．中国免疫学杂志，2010，26（8）：712－715．

[15] 赵晓峰,何海根,章建萍,史丽云  黄芪对免疫功能低下小鼠免疫功能的影响[J]．浙江中医药大学学报 2012,6（36)  749-751

[16] 宋燕华，蔡德雷，傅剑云，等．铁皮石斛叶对二代繁殖雌性大鼠免疫水平影响的研究［J］．浙江预防医学，2016，28( 2) : 109 －112．

[17]  Abul K Abbas， Andrew H Lichtman． Basic Immunology Updated Edition： Functions and Disorders of the Immune System［M］． Philadelphia：Saunders Elsevier． 2011：13－16

[18] 程东，韩晓英，姚文环，等． 铁皮石斛制剂免疫调节作用研究[J]．毒理学杂志， 2014， 28( 6) : 486 － 488．

[19] 宋美芳， 李光， 陈曦，等．两种石斛多糖提高小鼠免疫活性的初步研究[J]．中国药学杂志，2013，48( 6) : 428 － 431．

[20] 李光，宋美芳，李宜航，等．不同种类石斛多糖成分对小鼠脾脏免疫功能的影响[J]．中国临床药理学与治疗学，2012，17( 10) : 1108－1111．