CLDN1影响放疗后肝癌侵袭转移潜能变化的机理研究

   沙娅·玛哈提， 杨颖 ，肖蕾 ，毛睿 ，张瑞丽， 包永星

Shaya Mahati, Ying Yang，Lei Xiao, Rui Mao, Ruili Zhang,YongXing Bao

新疆医科大学第一附属医院肿瘤中心，新疆乌鲁木齐市，830054

 【摘要】目的 探讨放疗后肝癌侵袭转移能力的变化，并对其机理研究。方法 对肝癌细胞放疗前后中CLDN1表达进行比较，由于放疗后肝癌细胞侵袭转移潜能发生变化，确定其机理，并进一步探讨CLDN1 在其中的作用。结果 放疗后肝癌细胞侵袭转移潜能的变化与肝癌细胞获得肿瘤干细胞特性密切相关，另外发现，CLDN1在放疗前后差异显著(P<0.01)，而降低CLDN1的表达，其放疗后肝癌细胞获得肿瘤干细胞能力下降，肝癌细胞侵袭转移能力降低 (P<0.01)。结论 放疗后CLDN1可通过诱导肝癌细胞获得肿瘤干细胞特性，从而增强放疗后肝癌细胞侵袭转移能力。

【关键词】CLDN1；肝癌；肝癌干细胞特性；放疗

CLDN1 promotes cancer stem cell traits formation in hepatocellular carcinoma after irradiation

Abstract Objective To study the potential invasion and metastasis in HCC after irradiation. Methods Given 0Gy or 8Gy to the HCC cells, and western bolt assays were performed to test the expression of CD133 and CD44, which were markers of cancer stem-like cells (CSC) in HCC. CLDN1 were also examined before and after irradiation. Results The migration and invasion capacities of HCC cells were enhanced after irradiation, which were strongly correlated with CLDN1 expression. In addition, alternation of CLDN1 expression greatly influenced the cancer stem like phenotype formation, resulting in radiation resistance in HCC. Conclusion CLDN1 was correlated with CSC traits formation in HCC after irradiation.

Key words:  CLDN1; hepatocellular carcinoma; cancer stem-like cell; irradiation

原发性肝癌(主要是肝细胞肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一，具有高死亡率，预后极差的特点，目前是世界第二位癌症杀手^[1]，据统计世界55%的肝癌在中国。手术治疗仍是肝癌的首选治疗方式，但由于肝癌的一些特性，只有不到20％的肝癌患者就诊时适合手术^[2]。近些年来，为了提高不可切除肝癌的生存率，逐渐出现了射频治疗、经导管肝动脉化学栓塞治疗等治疗方式，但是均获益有限，具有局限性^[3]。放射治疗(以下简称放疗) 利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方法。大约60%-70%的癌症患者在治疗癌症的过程中需要用放射治疗，部分癌症可以用放疗根治。放射治疗在肿瘤治疗中的作用和地位日益突出，已成为治疗恶性肿瘤的主要手段之一。但是临床上，我们常常会观察的一个现象，既放射治疗后本已经缩小或者甚至消失的肿瘤组织，会在一定时间后出现复发、转移，预后甚差。我们推测放疗后残存肿瘤生物学特性的改变尤其是其侵袭转移潜能的变化可能是放疗结束后期患者迅速出现复发转移的重要原因之一^[4]。

紧密连接蛋白（CLDN1）是参与正常组织细胞之间连接的重要蛋白，属于细胞表面跨膜蛋白，CLDN家族的异常表达与多种肿瘤转移、复发等密切相关，但CLDN1在肝癌中的表达情况的研究尚少，且认识有一定的局限性，本文意在讨论CLDN1在放疗后肝癌中的表达情况，并其与肝癌复发、转移的相关性。

1 材料与方法

1.1 细胞系与培养基

肝癌细胞系HepG2 和Huh7来自美国模式培养物集存库，培养基为含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DEME(购自美国Gibco公司)，并置于37 ℃、CO2体积分数为 5%的培养箱中培养。    　　

1.2 细胞照射条件

用电子直线加速器照射HepG2及Huh7细胞，照射总剂量为8Gy,根据实验要求照射不同剂量，照射后细胞置于37 ℃、5% CO2 饱和湿度培养箱中继续培养。

1.3 Western blot检测 　　

采用Western blot对CD133、CD44以及CLDN1等蛋白检测。抗体均来自美国Cell Signaling Technology公司和Sigma公司。用蛋白裂解缓冲液裂解细胞，并用BCA法测定各蛋白浓度，主要用的抗体有CD133、CD44及CLDN1 GAPDH抗体。

1.4 细胞克隆试验

将照射前后处于对数生长期细胞消化成单细胞悬液，以1000个每培养基接种，经培养10天后语言结晶紫染色，于倒置显微 镜下计数 ＞50 个细胞的克隆数，并计算克隆形成率 ( PE) : PE( %) = ( 处理组克隆形成平均数/接种细 胞数) × 100%。细胞存活分数( SF) = 照射组 PE/ 未照射组 PE ×100%。试验重复3 次。

1.5 Transwell实验

购买Transwell小室，取300ul无血清培养基加入60ul Matrigel,混匀，在恒温箱中培养30min,使Matrigel聚合成胶；将细胞无血清培养12小时后胰酶消化，配成细胞悬液，计数细胞，后每个Transwell小室加入100ul细胞悬液，并在培养板中加入600ul培养基，观察细胞穿膜，小室放入培养板过程中注意不要有气泡产生，否则下层培养板趋化作用减弱。24小时后计算贴壁细胞个数，取出Transwell小室，弃去培养液，PBS洗涤2便，甲醛固定后结晶紫染色，显微镜下随机选取3-5个野计数。

1.6 肿瘤细胞成球能力

将处理后肝癌细胞HepG2，孵育后的细胞经胰酶消化、200目滤网滤过，打散成为单个细胞。放入无血清低黏附培养基中，一般来说普通细胞不能耐受无血清培养基，经1周后逐渐死亡，而具有肿瘤干细胞特性的细胞可以，将细胞分至6孔板中，每组3个孔，悬浮培养10天。观察细胞成球能力。

1.7流式细胞仪

0.25%胰酶消化细胞,将细胞吹打成单细胞悬液。冰 PBS 充分洗细胞两次,调整细胞浓度为 l×10⁶的细胞待测。用 300μl 结合缓冲液重新悬浮细胞。加入 5μAnnexin 和 5μl PI。摇晃试管混匀,室温避光孵育 30min。 离心弃去上清, 用 190μl 的结合缓冲液重新悬浮细胞。流式细胞仪检测,并使用 FCS Express2.0 软件进行数据分析

1.8统计学处理

用SPSS 11.0统计软件包处理，统计学方法采用t检验，Person相关分析，X²检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 放疗后肝癌细胞侵袭转移能力的变化

本研究中，分别测定0Gy及8Gy照射后的肝癌细胞在放疗后的24小时的转移侵袭能力，发现经8Gy照射的肝癌细胞其转移侵袭能力明显大于0Gy照射者，且发生转移侵袭的细胞数目明显增多(P<0.05)，详见图1。

图1     经8Gy放疗后肝癌细胞侵袭转移能力的改变

Fig1    Comparison of the migration and invasion capacity of different cells.  

2.2 放疗后肝癌细胞中CLDN1的表达

为了进一步验证CLDN1在放疗前后肝癌细胞中的表达情况，进行了验证，在放疗前后的肝癌细胞系中我们检测CLDN1的表达，发现经8Gy放疗组的肝癌细胞中CLDN1高表达，与未放疗组相比，其差异具有统计学意义（P<0.05
）,详见图2。

图2  经8Gy照射后肝癌细胞中CLDN 1表达显著升高

Fig2  Relative expression of CLDN1 enhanced after irradiation

2.3 放疗后肝癌细胞中CSC特性形成

既往大量研究表面，获得肿瘤干细胞特性的细胞其转移侵袭能力增强，为了明确放疗后肝癌细胞侵袭能力增强的原因，我们测定了经8Gy放疗后的肝癌细胞中其获得肿瘤干细胞特性的比例，既测定CD133及CD44的表达，发现经放疗后的细胞中CD133及CD44均高表达，其差异具有统计意义（P<0.05）。另外，发现放疗后肿瘤细胞成球能力较未放疗组增加（P<0.05），详见图3。

图3 经8Gy照射后细胞干性相关标记物、肿瘤细胞成球能力增加

Fig3 CSC pehnotype of HCC was increased after irradiation

2.4 CLDN1可促进后肝癌细胞获得肿瘤干细胞特性

因放疗后的肝癌细胞中CLDN1高表达，故假设CLDN1与放疗后肝癌细胞获得肿瘤干细胞特性相关，用siRNA敲除CLDN1的表达，并与原细胞比较其经8Gy放疗后细胞侵袭转移能力及CD133、CD44表达，发现CLDN1低表达组照射后肝癌细胞侵袭转移能力及CD133、CD44阳性表达率均较对照组低（P<0.05），且与未照射组相比，其转移、侵袭能力及干性相关标记物表达差异无明显改变，差异不具有统计学意义，详见图4及图5。

图4 敲除CLDN1表达后，8Gy照射后细胞转移、侵袭能力改变较前降低，且CD133及CD44表达明显降低

Fig4 alternation of CLDN1 expression influenced cell migration and invasion capacity and CSC formation after irradiation.

图5  对CLDN1低表达组及对照组予以0Gy，8Gy照射后测定CD133及CD44表达变化，提示CLDN1低表达组8Gy放疗组较CLDN1低表达0Gy放疗组及对照组相比CD133及CD44明显降低

Fig5 alternation of CLDN1 expression influenced CD133 and CD44 expression in HCC cells after irradiation

3.讨论

肝癌是恶性度较高的一类疾病，目前最有效的治疗方式仍是手术治疗，但因肝癌本身的一些特点，例如多灶性、易转移等一些特点，早期切除的可能性极低，尽管这些年来出现了肝动脉栓塞治疗、射频消融等技术，但其生存率依旧较低，主要是因为疾病诊疗过程中发了肿瘤复发、转移所致。

放射治疗在肝癌的治疗中地位日益突出，已成为治疗原发性肝癌不可或缺的治疗手段之一，但是临床工作中往往可以看见经放射治疗的肿瘤出现复发转移，如卵巢癌在放疗后会出现骨转移增加^[5]，同样的研究也出现乳腺癌中，即乳腺癌在放疗可引起肺转移增加^[6]。在肺癌中研究发现，放疗可促进细胞分泌VEGF同时增加细胞活动性，促进放疗后细胞的侵袭转移能力^[7]。而据统计，临床癌症患者即使接受根治性放疗后，仍有60％以上的患者病理证实仍有残存肿瘤存在，且患者会在短时间内出现转移。

肿瘤干细胞（CSCs）的概念首次是在白血病中提出的^[8]，被认为是一小部分，具有自我更新能力的细胞^[9]。到目前为止，人们已成功的从造血系统恶性肿瘤、乳腺癌和脑肿瘤患者组织中分离并培养出各自的肿瘤干细胞。肿瘤细胞异质性的现象可用肿瘤干细胞的理论才能解释，即肿瘤干细胞在不同选择压力下，向不同功能方向分化、成熟，从而形成异质性。肿瘤干细胞具有很多干细胞的表面标记物，例如CD10, CD24, CD44, CD133。现代医学提出了新的观点，只有针对肿瘤干细胞的治疗才能真正意义上消灭肿瘤^[10]。Sung woo hong等发表文章指出放疗可引起残肝癌细胞中CD133⁺的亚群增加^[11]，这意味着放疗后残癌细胞可能出现肿瘤干细胞化，获得更强侵袭性与增殖能力。类似研究在其他癌肿之中也有报道。本研究表明，经放疗后的肝癌细胞会出现侵袭、转移能力的增强，而放疗后肝癌细胞获得肿瘤干细胞特性是放疗后肿瘤细胞侵袭、转移能力增强的机制之一。CSCs通过DNA修复、调整细胞周期、清除活性氧和维持特定的肿瘤微环境等多种途径来逃避放射治疗对其的杀伤作用,其中涉及多种基因和信号通路。研究CSCs放疗抵抗机制,可以通过改进放疗技术或设计靶向治疗药物解除放疗抵抗效应。

CLDN1与细胞间紧密连接有关，它在不同的癌肿之中扮演的角色不同，例如在宫颈癌、卵巢癌中，CLDN1可促进肿瘤侵袭转移，而在肺癌中却相反。既往研究表明，CLDN1在肝癌中高表达，此作用可能会破坏细胞极性，使肝癌细胞更容易脱离正常细胞对其的束缚，从而增强细胞侵袭转移能力。本研究中，我们发现CLDN1的表达水平与肝癌细胞获得肿瘤干细胞特性明显相关,而CLDN1的改变也促进了放疗后肝癌细胞侵袭转移能力。如果基因转染等方式降低患者肝癌细胞中CLDN1的表达，可改善患者预后，降低放疗后肝癌发生转移的可能性，从而提高预后。

基金资助

国家重点研发计划资助，项目编号 2017YFC0909900

参考文献

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