病毒性出血性败血症病毒(VHSV)可视化核酸试纸条

检测方法的研究

房保海，金莹，岳志芹，孙涛，曲凌云，王宫璞，梁成珠，徐彪

(1.山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心：山东 青岛 266002；

2.黄岛出入境检验检疫局：山东 青岛 266555；

3.国家海洋局第一海洋研究所：山东 青岛 266000）

摘要: 目的：本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测病毒性出血性败血症病毒核酸的方法。方法：本研究在病毒性出血性败血症病毒5’端保守区设计一对保守引物，其中上、下游引物的5’端分别修饰有生物素（biotin）和异硫氰酸荧光素（FITC），核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体。将扩增产物与展开液混合后点样，10 min 后即可用肉眼判读结果。在优化了上样浓度之后，对该方法的灵敏度进行了评价。结果：试纸条检测VHSV的灵敏度可达到33 copies /μL，比凝胶成像检测技术灵敏度要高出10倍。结论：核酸试纸条技术能够用于VHSV的可视化检测，该方法快速、灵敏、具有良好的特异性，为VHSV的流行病学调查及预防控制提供了新的方法学基础。

关键词: 病毒性出血性败血症病毒；核酸试纸条；可视化检测

中图分类号: S941.41     文献标志码: A    文章编号:

病毒性出血性败血症病毒（Viral hemorrhgic septicemia virus，VHSV）属弹状病毒科、粒外弹状病毒属的成员，可感染虹鳟鱼、养殖大菱鲆、牙鲆、白鲑和大西洋鳕鱼等数十种鱼类的一种烈性传染病毒，表现为出血性败血症，死亡率可达90%-100%^[1]。该病主要流行于欧洲及北美地区，近年来扩散到日本和韩国^[2]。世界动物卫生组织（OIE）要求须申报的疫病，我国将其列为二类进境动物检疫疫病^[3]名录。VHSV基因组为一段单链负链RNA，其线性基因组编码5个蛋白，包括：核衣壳蛋白(N 蛋白)、两个结构蛋白(M1和M2蛋白)、糖蛋白(G蛋白)和RNA聚合酶(L蛋白)；VHSV粒子长约180 nm，宽约70 nm；其基因组长度约12000个碱基^[2,4]。

目前，国际上检测病毒性出血性败血症病毒通常采用的方法是细胞培养分离病毒法（OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals（2012）chapter 2.3.9 viral haemorrhagic septicaemia）、血清学方法^[5-7]、巢式RT-PCR法^[9]、实时荧光RT-PCR法^[10-11]、荧光环介导逆转录等温扩增^[5]等。细胞培养分离VHSV法结果可靠，但是检测周期长，不适用于快速鉴别诊断；传统的病毒细胞培养法和血清学法均受限于各自的特点，检测费时费力，难于满足快速检测的需要。因此，探讨其快速诊断方法，对病毒性出血性败血症病毒的疫情监控及流行病学调查，从而采取相应的防治措施具有重要意义。核酸检测试纸条技术是通过核酸引物或探针两端修饰相应标记物(如生物素、荧光素)，同时试纸条上相应位置标记对应抗体，就可以实现核酸产物的试纸条检测^[13-15]，该技术已经结核分枝杆菌、甲型H1N1病毒、外源基因EPSPS的检测^[16]。本研究在病毒性出血性败血症病毒5’端保守区设计引物，建立VHSV可视化核酸试纸条检测技术，并对其反应条件进行优化，证实了该方法快速、灵敏、具有良好的特异性。

1　材料与方法

1.1　病毒和细胞系

病毒性出血性败血症病毒（VHSV）（本实验保存）及RNA、传染性造血组织坏死病病毒（infectious haematopoietic necrosis virus，IHNV）RNA、锦鲤疱疹病毒（Koi herpevirus，KHV）鲤春病毒（spring viraemia of carp virus，SVCV）RNA等病毒均由本实验室保存。

1.2　主要试剂和仪器

DL2000 DNA marker（购自天根公司）

PrimeScript^TM ONE STEP RT-PCR Kit Ver.2（购自宝生物工程（大连）有限公司）；

琼脂糖（购自美国Promega公司）；

通用型核酸扩增物快速检测试纸条（购自杭州优思达生物技术有限公司）；

ABI Proflex PCR仪（ABI公司）。

RNA提取试剂盒：QIAGEN RNeasy mini kit（74106）。

1.3 引物设计和RT-PCR扩增

参照GenBank 内VHSV全基因序列（AB672614.1、AB672618.1、AB672619.1、AB672620.1、AB839745.1、AB839746.1、D00687.1、AJ233396.1、FN665788.1、X73873.1、X73873.1、Z93412.2、AF012093.1、AF143862.1、AF143863.1、FJ460590.1、GQ325430.1、GQ325431.1、GU066860.1、KC468556.1），并用DNSTar进行序列比对，在VHSV基因组 5’端保守区设计引物，引物序列为VHSV281-F（CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT）（5’端标记FITC）和VHSV281-R （TCCCCGAGTTTCTTGGTGATGTA）（5’端标记biotin），扩增长度为281 bp。

RT-PCR扩增参数为：50℃ 30 min进行逆转录；95℃ 2 min；然后进行35 次PCR循环（94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 30s 循环）；72 ℃ 7min；4℃保温。

1.4 PCR产物试纸条检测方法及定性判读

将试纸条平放，取5 μL扩增产物滴加在试纸条的样品垫上，同时滴加2～3滴缓冲液，室温下10 min后判读结果，T线（检测线）显色，结果为阳性；T线（检测线）不显色，结果为阴性；若C线（质控线）不显色，则试纸条无效。

1.5 VHSV核酸试纸条检测方法的灵敏度测试

将VHSV 假病毒核酸用灭菌ddH₂O稀释至6.6、33、66、6.6×10²、6.6×10³、6.6×10⁴、6.6×10⁵、6.6×10⁶、6.6×10⁷拷贝/μL，再进行RT-PCR，扩增产物分别稀释，每个稀释梯度各取稀释后产物5 μL进行核酸试纸条检测、观察并记录结果。

1.6 实际样品的VHSV检测和灵敏度比较

采用RNA提取试剂盒QIAGEN RNeasy mini kit（74106）提取VHSV病毒RNA，将VHSV 病毒核酸RNA用灭菌ddH₂O进行10×梯度稀释，再进行RT-PCR，扩增产物分别稀释，每个稀释梯度各取稀释后产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳和核酸试纸条检测，分别在凝胶成像系统、核酸试纸条上观察并记录结果。

２　结果及分析

2.1 检测原理

核酸试纸条检测病毒性出血性败血症病毒的原理如图1。使用一对特异性引物扩增从血清中提取得到的病毒基因组，上、下游引物的5ˊ端分别修饰有荧光素（F）和生物素（B）。扩增产物无需纯化，与展开液混合后点在试剂条的加样孔处，混合液通过毛细作用向前流动。当有扩增产物存在时，扩增产物一端修饰的生物素首先与金标垫上修饰有异硫氰酸荧光素（SA）的胶体金结合，接着液相继续流动到达检测线，固定在检测线上的抗荧光素抗体（Anti-F）将一端修饰有荧光素的扩增产物捕获，这样就使扩增产物一端结合的胶体金都停留在检测线处，产生红色的条带。多余的胶体金继续层析，最终被质控线上的生物素（B）捕获，使质控线同样显色。当扩增产物不存在时，胶体金颗粒无法停留在检测线处，而被质控线上的生物素捕获，所以质控线的显色情况可以用来对试纸条进行质控。

Fig.1  Schematic illustration of the nucleic acid dipstick assay. S:sample application area; T:test zone for HEV; C:control zone; F:fluorescein isothiocyanate; B:biotin; Au:gold nanoparticles; SA:streptavidin; Anti-F:anti-fluorescein; BSA: bovine serum albumin.

2.2 VHSV试纸条检测结果

提取VHSV总RNA，进行RT-PCR检测，扩增产物滴加在试纸条的样品垫上检测，在检测带区域出现明显红色条带，空白对照没有红色条带（图1）。

                          VHSV             空白对照

图1 VHSV核酸试纸条检测结果

2.3 核酸试纸条方法的特异性考察

用VHSV281-F和VHSV281-R引物对VHSV、IHNV、SVCV RNA进行RT-PCR扩增并进行核酸试纸条检测，从检测结果可以看出（图2），只有VHSV扩增产物出现特异性红色条带，IHNV、SVCV和空白对照在检测线位置均无条带出现，显示了对VHSV良好的特异性。

                 VHSV            IHNV         SVCV         KHV       空白对照

图2 核酸试纸条检测VHSV的特异性

2.4 核酸试纸条方法的灵敏度

为了考察方法的灵敏度，提取并测定VHSV假病毒RNA的浓度，分别稀释成6.6、33、66、6.6×10²、6.6×10³、6.6×10⁴、6.6×10⁵、6.6×10⁶、6.6×10⁷ copies /μL, 进行RT-PCR, 用核酸试纸条进行检测，从结果可以看出（图3），核酸试纸条方法检测限可以达到33 copies /μL。现阶段供临床使用的商品化荧光检测试剂盒，其检测下限一般为500 copies /μL。因此，核酸试纸条法同样可以满足检测低拷贝病毒血样的要求。

            6.6           33             66           6.6×10²       6.6×10³

6.6×10⁴       6.6×10⁵      6.6×10⁶               6.6×10⁷       空白对照

图3 VHSV核酸试纸条方法的灵敏度测试

2.5 实际样品的VHSV检测和灵敏度比较

为了考察方法的准确性和特异性， 采用RNA提取试剂盒QIAGEN RNeasy mini kit（74106）提取VHSV病毒RNA，进行10倍梯度稀释至10⁹倍, 进行RT-PCR, 分别用凝胶成像法和核酸试纸条法进行检测，从结果可以看出（图4），核酸试纸条方法可以检测可以达到10⁸稀释倍数，比凝胶成像法灵敏度高出10倍。

          原倍          10^-1倍        10^-2倍       10^-3倍        10^-4倍

    10^-5倍       10^-6倍        10^-7倍        10^-8倍       10^-9倍      空白对照

图4 实际样品的VHSV检测和灵敏度比较

3 结论和讨论

直到上世纪 80 年代末，VHS 疫情仅限于欧洲大陆养殖虹鳟。过去的 20 多年，VHSV 已从整个北半球温带地区淡水和海洋水域的野生鱼类中分离到。在亚洲，有报道日本的养殖牙鲆暴发该疾病以及从野生鱼类中分到该病毒^[18]。在美洲，VHS 主要引起野生鱼类死亡。最近发现由于 VHSV 宿主范围较大，在不同宿主的致病性具有显著差异，使得控制 VHS 较为困难。随着我国虹鳟养殖业的发展，虹鳟苗种、成鱼及其产品的进口量急剧增加，VHSV 传入我国的风险较高。因此，建立该病毒的检测方法用于进出境鱼类检疫是有效防止病毒传入的重要手段。

对VHSV的检测来说PCR检测是一种较为快速且灵敏、特异的检测方法。传统的RNA病毒核酸PCR检测方法是将RNA病毒的RNA转录成cDNA再进行PCR，RNA在操作中很容易被降解，导致一部分的阳性结果检测不到。一步法RT-PCR减少了RNA转录操作过程中的损失，通过一步法巢式RT-PCR，更是能检测到pg级的VHSV RNA。但PCR的结果通过琼脂糖凝胶电泳来判断的话，常会造成实验室的污染，尤其是巢式PCR需要将第一轮的扩增产物加入第二轮反应体系中再进行扩增，这无疑会产生气溶胶污染，导致假阳性结果的产生。Taqman MGB探针快速定量检测VHSV具有极高的灵敏度和特异性，但其需要昂贵的荧光PCR仪以及检测探针，限制了该技术的推广。

本研究通过将一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）与核酸试纸条检测方法相结合，首次建立了一种核酸试纸条可视化检测VHSV的方法，无需凝胶电泳检测RT-PCR扩增产物所需要的制胶、电泳、成像等步骤，将2 h的检测时间缩短为10 min左右，大大提高了检测效率并能够裸眼判读^[6]；灵敏度试验结果表明核酸试纸条法的检测灵敏度比传统电泳凝胶成像高至少10倍；同时该方法检测完后只产生少量的纸质垃圾，处理简单，避免了使用溴化乙锭等核酸染色剂对环境的污染，且大大降低了交叉污染的可能性^[20]。初步的应用结果证明，可视化快速核酸试纸条法具有操作便利、特异性好、灵敏度高，结果直观、稳定、可靠、对环境友好等多项优点，适合检疫实验室进行VHSV的快速筛查。本方法的建立为VHSV的流行病学调查及预防控制提供了新的方法学基础。

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Visual nucleic acid test strips for rapid detection of viralhaemorrhaic septicaemia virus

FANG Bao-hai^*1, JIN Ying², YUE Zhiqin¹, SUN Tao¹, QU Lingyun³, WANG Gongpu¹, LIANG Chengzhu¹, XU Biao¹

1. Inspection and Quarantine Technical Center of the Shandong Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, Shandong, China

2. Huangdao Exit & Entry Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266555, Shandong, China

3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266000, Shandong, China

ABSTRACT:  Objective: We aimed to develop a nucleic acid dipstick assay (NADA) for rapid and visual detection of Hepatitis B virus (HBV) with a high specificity and sensitivity. Methods: PCR amplification of HBV conserved sequences was carried out by a pair of primers labeled with FITC and biotin at the 5' end respectively. The gold nanoparticles and test zones in the dipstick were modified with anti-fluorescein and strepavidin respectively. PCR products mixed with developing buffer were applied to the sample-loading area of the dipstick and the detection result can be observed 10 min afterward with naked eyes. As the buffer migrates along the strip by capillary action, the PCR products were captured at the test zones by immobilized anti-fluorescein and detected by strepavidin-funtcionalized gold nanoparticles, thus generating characteristic red lines. The excess nanoparticles were captured by immobilized biotinylated albumin at the control zone of the strip and then form another red line. We have optimized the developing buffer as well as the concentration for sample-loading. The sensitivity of the optimized NADA has also been evaluated. Results: The sensitivity of NADA for visual detection of HBV was 33 copies/mL. It is 10 times more sensitive than Gel imaging detection technology. Conclusions: Our newly developed NADA could be applied for visual detection of HBV. Compared with qPCR, NADA have the advantages of the rapidity, higher sensitivity and specificity, and provide a new basis of methodology for epidemiological investigation, prevention and control of VHSV.

Key words: viralhaemorrhaic septicaemia virus(VHSV); nucleic acid strip; visual detection